Sirt3在氧化应激介导的神经损伤中的作用及相关机制研究

发布时间：2021-03-25 20:31

　　研究背景和目的Sirtuin（Sirt1-7）是系统发育中高度保守的烟酰胺腺嘌呤核苷酸（NAD+）依赖性蛋白脱乙酰化酶家族。其中Sirt3主要存在于线粒体中,具有应激反应性脱乙酰酶活性,在多种病理条件下起到了减轻细胞损伤的作用。在热量限制和应激等状态下,Sirt3可以调节线粒体功能,影响线粒体代谢,其中包括调控三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）的产生。然而,Sirt3在氧化应激性神经元损伤中的作用并未完全明确。Sirt1是这个家族中另一个特征明显的成员。已有研究证实Sirt1在抵抗细胞应激性反应中发挥了重要作用。然而,Sirt1和Sirt3之间的相互作用仍有待进一步研究。自噬是细胞精确调控的自我消化过程,在饥饿、分化及细胞正常生长时通过溶酶体系统吞噬胞质内大分子及细胞器,以维持细胞的生存、分化、生长以及稳定。细胞通过自噬机制选择性地清除受损伤或不需要的线粒体的过程被称为线粒体自噬。线粒体自噬可以作为一种防御机制清除损伤的线粒体和过量产生的ROS,确保细胞内线粒体功能稳定,促进应激环境中细胞的存活;反之,如果线粒体自噬的防御功能得不到充分发挥,过量产生的ROS将诱导细胞进入凋亡等途径... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
Abstract
前言
文献回顾
    第一部分 Sirt3与中枢神经系统疾病
        1. Sirtuin概述
        2. Sirt3的分子生物学功能
            2.1 Sirt3的表达与调控
            2.2 Sirt3在调节细胞存活与死亡中的作用
            2.3 Sirt3与衰老
            2.4 Sirt3与能量平衡
            2.5 Sirt3与氧化应激
        3. Sirt3在中枢神经系统疾病中的作用
            3.1 Sirt3与阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease,AD）
            3.2 Sirt3与亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease,HD）
            3.3 Sirt3与肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis ALS）
            3.4 Sirt3与年龄相关性听力损失（Age-related hearing loss,AHL）
    第二部分 自噬在氧化应激性损伤中的作用
        1. 自噬概述
        2. 自噬与氧化应激
        3. 氧化应激与DNA损伤
        4. DNA损伤与自噬
第一部分 Sirt3对过氧化氢引起的氧化应激性损伤的作用
    引言
    1 材料
        1.1 细胞株
        1.2 小干扰RNA （Small interfering RNA;siRNA）的构建
        1.3 慢病毒的构建
        1.4 实验试剂
        1.5 主要仪器
    2 方法
        2.1 体外细胞培养
2O₂细胞损伤模型的建立">        2.2 H₂O₂细胞损伤模型的建立
        2.3 细胞活性检测
        2.4 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放检测
        2.5 siRNA转染
        2.6 慢病毒转染
+/NADH比值检测">        2.7 NAD⁺/NADH比值检测
        2.8 活性氧（ROS）生成检测
        2.9 脂质过氧化物检测
        2.10 抗氧化酶活性检测
        2.11 细胞线粒体的提取
        2.12 线粒体呼吸链复合体活性检测
        2.13 三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）合成检测
        2.14 线粒体肿胀检测
        2.15 线粒体钙缓冲容积检测
        2.16 流式细胞分选
        2.17 细胞色素c（cytochrome c）释放检测
        2.18 半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性检测
        2.19 免疫印迹（Western Blot,WB）实验
        2.20 统计学分析
    3 结果
2O₂损伤的HT22模型中Sirt3的表达变化">        3.1 在H₂O₂损伤的HT22模型中Sirt3的表达变化
2O₂导致的Sirt3表达增高可以促进HT22细胞的存活">        3.2 H₂O₂导致的Sirt3表达增高可以促进HT22细胞的存活
        3.3 过表达Sirt3后可减轻ROS的产生及脂质过氧化反应
        3.4 Sirt3过表达可以保护线粒体呼吸链功能,增加ATP产生
2O₂导致的线粒体功能障碍">        3.5 过表达Sirt3可减轻H₂O₂导致的线粒体功能障碍
        3.6 过表达Sirt3可抑制线粒体介导的细胞凋亡
    4 讨论
第二部分 Sirt3调节线粒体功能在氧化应激性神经元损伤中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 siRNA的构建（与第一部分材料相同）
        1.3 慢病毒的构建（与第一部分材料相同）
        1.4 实验试剂
        1.5 主要仪器
        1.6 动物实验操作器材
    2 方法
        2.1 小鼠原代皮层神经元培养
2O₂神经元损伤模型的建立（与第一部分方法相同）">        2.2 H₂O₂神经元损伤模型的建立（与第一部分方法相同）
        2.3 免疫细胞化学（Immunocytochemistry, ICC）
        2.4 siRNA转染（与第一部分方法相同）
        2.5 慢病毒转染（与第一部分方法相同）
        2.6 神经元活性检测（与第一部分方法相同）
        2.7 LDH释放检测（与第一部分方法相同）
        2.8 细胞色素c释放检测（与第一部分方法相同）
        2.9 ROS生成检测（与第一部分方法相同）
        2.10 caspase-3活性检测（与第一部分方法相同）
        2.11 抗氧化物酶活性检测（与第一部分方法相同）
        2.12 钙离子呈像
        2.13 线粒体DNA含量检测
        2.14 ATP合成检测（与第一部分方法相同）
        2.15 实时荧光定量反转录PCR （RT-qPCR）
        2.16 WB实验（与第一部分方法相同）
        2.17 统计学分析（与第一部分方法相同）
    3 结果
2O₂造成的原代皮层神经元损伤模型中的表达变化">        3.1 Sirt3在H₂O₂造成的原代皮层神经元损伤模型中的表达变化
2O₂造成的Sirt3表达增高可促进损伤后神经元的存活">        3.2 H₂O₂造成的Sirt3表达增高可促进损伤后神经元的存活
2O₂导致的神经元损伤">        3.3 Sirt3过表达可减轻H₂O₂导致的神经元损伤
2O₂造成的氧化应激性损伤">        3.4 Sirt3过表达可以抑制H₂O₂造成的氧化应激性损伤
2O₂造成的线粒体内钙紊乱">        3.5 Sirt3过表达可以减轻H₂O₂造成的线粒体内钙紊乱
2O₂损伤后促进线粒体的生物合成">        3.6 Sirt3过表达可在H₂O₂损伤后促进线粒体的生物合成
    4 讨论
第三部分 Sirt3调控神经元自噬在氧化应激性神经元损伤中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 实验动物（与第二部分材料相同）
        1.2 慢病毒的构建（与第二部分材料相同）
        1.3 实验试剂
        1.4 主要仪器
        1.5 动物实验操作器材（与第二部分材料相同）
    2 方法
        2.1 小鼠原代皮层神经元培养（与第二部分方法相同）
        2.2 神经元氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型的建立
        2.3 慢病毒转染（与第一部分方法相同）
        2.4 细胞活性检测（与第一部分方法相同）
        2.5 TUNEL染色
        2.6 Caspase-3活性检测（与第一部分方法相同）
        2.7 透射电子显微镜检测
2O₂检测">        2.8 ROS-GLO法H₂O₂检测
2O₂含量">        2.9 通过氨基三唑介导过氧化氢酶灭活测定细胞内H₂O₂含量
        2.10 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测
        2.11 ATP合成检测（与第一部分方法相同）
        2.12 免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC） （与第二部分方法相同）
        2.13 WB实验（与第一部分方法相同）
        2.14 统计学分析（与第一部分方法相同）
    3 结果
        3.1 Sirt3对皮质神经元缺血有保护作用
        3.2 Sirt3对线粒体功能及细胞生物学功能有保护作用
        3.3 Sirt3参与调节神经元缺血性损伤后的神经元自噬
        3.4 神经元自噬与Sirt3的神经保护作用密切相关
        3.5 Sirt3通过AMPK-mTOR途径发挥其保护作用
    4 讨论
第四部分 Sirt1-Sirt3轴通过影响血脑屏障通透性在氧化应激性神经损伤中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 细胞系
        1.2 siRNA的构建
        1.3 实验试剂
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 体外血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）模型的构建
        2.2 OGD氧化应激性损伤模型的建立（与第三部分方法相同）
        2.3 siRNA转染（与第一部分方法相同）
        2.4 血脑屏障通透性检测
        2.5 流式细胞分选（与第一部分方法相同）
        2.6 线粒体分离和提取（与第一部分方法相同）
        2.7 线粒体中ROS含量的检测
        2.8 WB实验（与第一部分方法相同）
        2.9 统计学分析（与第一部分方法相同）
    3 结果
        3.1 Sirt1与Sirt3对氧化应激性损伤后BBB通透性具有相反的作用
        3.2 在OGD损伤模型中,Sirt1通过AMPK-PGC1信号途径调控Sirt3的表达
        3.3 Sirt1-Sirt3轴可影响OGD介导的BBB通透性增高
        3.4 在BBB模型中,Sirt1-Sirt3轴可调控OGD介导的细胞损伤
        3.5 线粒体ROS产生参与了Sirt1-Sirt3轴对OGD介导的BBB通透性及细胞损伤的调控
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]SIRT1 suppresses PMA and ionomycin-induced ICAM-1 expression in endothelial cells[J]. JIA YuYan,GAO Peng,CHEN HouZao,WAN YanZhen,ZHANG Ran,ZHANG ZhuQin,YANG RuiFeng,WANG Xu,XU Jing,LIU DePei.  Science China（Life Sciences）. 2013(01)



本文编号：3100282