热休克蛋白70在SK-N-SH细胞氧糖剥夺后处理中的保护作用及机制研究

发布时间：2017-04-16 20:09

  本文关键词：热休克蛋白70在SK-N-SH细胞氧糖剥夺后处理中的保护作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:脑缺血后处理(recebral ischemic postconditioning,RIPost C)是在缺血预处理的基础上发展而来的,因其在缺血后施行,时机易于掌握,可控性强,比缺血预处理具有更好的应用前景和实用价值,也是启动内源性保护机制的重要方式。RIPost C是指在脑缺血后再灌注早期给予多次短暂的亚致死性的缺血与再灌注处理,使脑组织对缺血产生耐受性,调动机体内源性保护机制,减轻缺血再灌注损伤。关于RIPost C保护作用的具体机制,目前尚不清楚,但保护性蛋白质的作用备受关注。热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是真核及原核生物产生的具有维持细胞正常生理功能、增强细胞抗损害能力的应激性保护性蛋白,它在脑缺血预处理中的保护作用已进行了大量的研究,但在后处理中的作用机制尚不明确。RIPost C在动物模型上研究的较多,而体外研究的较少。动物模型研究易受体内外多种不可控因素的影响,而体外研究可以通过严格控制实验条件来避免影响,补充体内实验研究的不足,提高研究结果的完整性。SK-N-SH细胞为人类神经母细胞瘤细胞株,不仅具有神经细胞的形态学特征,还具有肿瘤细胞无限增殖的能力,比神经细胞更容易培养,被广泛的应用于神经细胞缺血性损伤的研究中。所以,本课题将通过体外培养SK-N-SH细胞,对细胞进行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养,之后再通过进行短暂交替的氧糖剥夺与复氧糖的处理方式制作氧糖剥夺后处理(oxygen glucose deprivation postcoditioning,OGDP)体外模型。从细胞水平,探讨HSP70在OGDP中的保护作用及相关机制,为脑血管病新药的开发及防治提供新的思路。目的:1、观察OGDP对OGD再灌注损伤的保护作用;2、观察HSP70在氧糖剥夺后处理中的表达及其对凋亡细胞的影响;3、探讨HSP70在氧糖剥夺后处理中抑制细胞凋亡的可能机制。方法:1、体外培养SK-N-SH细胞2-3天,当细胞处于对数生长期时,被随机分为:(1)正常对照组:细胞始终置于DMEM高糖培养液中正常培养;(2)氧糖剥夺组(OGD组):应用终浓度为5mmol/L的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)和无糖Earle’s液对细胞先进行氧糖剥夺4h(即OGD处理4h),再换成DMEM高糖培养液继续培养至24h;(3)糖剥夺后处理组(OGDP组):对细胞先进行OGD处理4h,再进行数次短暂交替的复氧糖(re-oxygenl-glucose,ROG)和氧糖剥夺,即为氧糖剥夺后处理。根据处理时间和循环次数,OGDP组又分为3个亚组,处理方法如下,所有亚组处理结束后恢复正常培养至24h:(1)第1个OGDP亚组(OGD4h+3次×5min组):OGD处理4h,ROG 5min后OGD 5min(此为1个循环),然后再重复以上过程2次(共3个循环);(2)第2个OGDP亚组(OGD4h+3次×10min组):OGD处理4h,ROG 10min后OGD 10min(此为1个循环),然后再重复以上过程2次(共3个循环);(3)第3个OGDP亚组(OGD4h+3次×15min组):OGD处理4h,ROG 15min后OGD 15min(此为1个循环),然后再重复以上过程2次(共3个循环);应用噻唑蓝比色法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)检测各组细胞存活率,并用倒置相差显微镜对细胞形态学改变进行观察。2、分组:对照组、OGD组、OGDP组:选择OGDP第2亚组:OGD处理4h后实施3次循环的复氧糖10min后氧糖剥夺10min,再恢复正常培养至24h。细胞免疫化学法检测各组HSP70的表达,并进行阳性细胞计数。吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染法记录各组细胞荧光改变并计算各组细胞凋亡率。3、分组:对照组、OGD组、OGDP组。细胞免疫化学法检测各组Bcl-2的表达,并进行阳性细胞计数。结果:1.1 OGDP各组细胞存活率的变化:对照组的存活率为100%,OGD组细胞存活率为(53.94±6.66)%,OGDP各亚组中,第1、2、3亚组细胞存活率分别为:(58.20±6.86)%、(70.72±7.64)%、(58.43±6.83)%。与对照组相比,OGD、OGDP组细胞存活率均显著性降低(P0.01)。与OGD组相比,在OGDP各亚组中,虽然第1、3亚组也能提高细胞存活率(P0.05),但第2亚组细胞存活率提高最为明显,增加了约16.78%,差异具有统计学意义(P0.01),提示第2亚组保护作用最强。1.2细胞形态学观察:对照组的细胞始终处于正常条件下培养,细胞生长状态极佳,数量较多,各个细胞间紧密毗邻,呈长梭形或不规则样,生长迅速,边界清楚,折光性强。OGD组细胞的生长情况较正常培养明显下降,细胞间紧密性差,数量减少,生长速度较缓慢,死亡数目增多。与OGD组相比,OGDP组细胞数量显著增多,多数形态正常,贴壁状态较好,折光性上升,仅有少数细胞胞体皱缩变圆。2.1细胞免疫化学法检测HSP70的表达:对照组、OGD组、OGDP组HSP70阳性细胞数分别为(4.53±0.77)个/HP、(21.56±1.75)个/HP、(30.71±3.13)个/HP。相比较于对照组,OGDP和OGD组HSP70呈过表达,均明显提高;且OGDP组HSP70表达显著高于OGD组(P0.01)。2.2 AO/EB双染法检测凋亡:在对照组中,细胞大多数是正常结构,呈均匀的绿色荧光,仅少数细胞荧光颜色较亮(即仅少数处于早期凋亡阶段);OGD组细胞大部分呈现颜色更亮的荧光(即基本上处于早期凋亡),细胞核聚集,染色加深;OGDP组较OGD组,细胞核荧光颜色明显变淡,早期凋亡细胞数明显减少,胞核形态趋于规则。凋亡计数结果显示:对照组、OGD组、OGDP组细胞凋亡率分别为:(5.25±1.19)%、(43.35±4.88)%、(35.25±3.44)%。与对照组相比,OGDP、OGD组细胞凋亡率明显增高,P0.01;与OGD组相比,OGDP组细胞凋亡率显著低于OGD组P0.01。3.细胞免疫化学法检测Bcl-2的表达:对照组、OGD组、OGDP组Bcl-2蛋白阳性细胞数分别为(4.8±0.837)个/HP、22.2±2.86)个/HP、(46.2±2.38)个/HP。与对照组相比,OGDP组和OGD组Bcl-2蛋白表达水平均显著增高(P0.01),但OGDP组Bcl-2表达显著高于OGD组(P0.01)。结论:1、通过比较OGDP不同处理时间对各组细胞存活率的影响,提示OGDP对OGD再灌注损伤具有明显的保护作用,且在3次循环复氧糖10min后,氧糖剥夺10min时最为显著。2、HSP70的过表达在OGDP抗氧糖剥夺再灌注损伤中具有很重要的作用,且可能是通过抑制细胞凋亡实现的。3、HSP70在OGDP中抑制细胞凋亡的作用可能是通过促进Bcl-2蛋白的表达实现的。
【关键词】：氧糖剥夺后处理 氧糖剥夺再灌注损伤 细胞凋亡 热休克蛋白70 Bcl-2
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩略词表13-14
• 前言14-18
• 第一部分 氧糖剥夺后处理对氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用18-30
• 1.1 前言18
• 1.2 实验材料18-21
• 1.2.1 细胞品系18-19
• 1.2.2 实验主要试剂19
• 1.2.3 实验主要仪器19-20
• 1.2.4 实验用液的配制20-21
• 1.3 实验内容与方法21-25
• 1.3.1 SK-N-SH细胞株的培养方法21-24
• 1.3.2 OGDP各组对细胞存活率的影响24-25
• 1.3.4 统计学处理25
• 1.4 实验结果25-27
• 1.4.1 OGDP各组对细胞存活率的影响25-26
• 1.4.2 细胞形态学观察26-27
• 1.5 讨论27-30
• 第二部分 HSP70在氧糖剥夺后处理中的表达和对凋亡细胞的影响30-39
• 2.1 前言30-31
• 2.2 实验材料31
• 2.2.1 主要试剂31
• 2.2.2 实验溶液的配制31
• 2.3 实验内容与方法31-33
• 2.3.1 SK-N-SH细胞的培养31
• 2.3.2 SABC法检测各组HSP70的表达31-32
• 2.3.3 AO/EB双染法检测各组细胞凋亡率32-33
• 2.3.4 统计学方法33
• 2.4 结果33-36
• 2.4.1 SABC法检测各组HSP70的表达33-34
• 2.4.2 AO/EB双染法检测各组细胞凋亡34-36
• 2.5 讨论36-39
• 第三部分 HSP70在氧糖剥夺后处理中抑制细胞凋亡的可能机制39-45
• 3.1 前言39
• 3.2 实验材料39-40
• 3.2.1 主要试剂39-40
• 3.2.2 实验溶液的配制40
• 3.3 实验内容与方法40-41
• 3.3.1 SK-N-SH细胞的培养40
• 3.3.2 SABC法检测各组Bcl-2 的表达40-41
• 3.3.3 统计学方法41
• 3.4 结果41-43
• 3.4.1 SABC法检测各组Bcl-2 的表达41-43
• 3.5 讨论43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 文献综述 热休克蛋白70在脑缺血后处理中的研究进展50-64
• 参考文献59-64
• 致谢64-66

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