EZH2参与调控胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的机理研究

发布时间：2017-05-10 07:02

  本文关键词：EZH2参与调控胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脑胶质瘤是颅内最为常见的原发性脑肿瘤,约2/3为恶性胶质瘤。尽管目前常规手术、放疗和化疗等综合措施取得了长足进步,但胶质母细胞瘤(GBM)的2年生存率仍不到30%。临床上常出现相同级别和相同治疗方案的脑胶质瘤患者存在明显预后不同的现象,究其原因可能与肿瘤内在的生物特性以及对化疗的敏感性密切相关。近年来脑胶质瘤的化疗逐步得到重视,TMZ已成为辅助化疗中的一线药物,因此影响化疗敏感性以及探讨其机理也成为临床神经外科十分关注的课题之一。果蝇zeste基因增强子同源物2即EZH2作为PRC2的催化亚基,它可以在组蛋白3上的27位赖氨酸上添加3个甲基基团。这种3甲基化后的组蛋白可以导致染色质凝集和很多与肿瘤增殖、侵袭性以及血管生成等方面有关的癌基因或抑癌基因在表观遗传学上的激活或沉默。本研究拟体外在U87、U251、T98三个胶质母细胞瘤细胞株中分析EZH2的表达差异,构建EZH2慢病毒干扰的GBM转染株,建立EZH2表达量不同的GBM细胞株,然后检测其对替莫唑胺的敏感性的变化,同时进一步测定EZH2的表达水平与DNA损伤修复蛋白表达量的关系,并通过抑制DNA损伤修复通路中的关键蛋白来检测GBM对替莫唑胺的敏感性变化,从而探讨DNA损伤修复途径在EZH2调控GBM对化疗耐药中的作用。实验分为两部分:第一部分,研究EZH2表达水平与GBM对TMZ化疗敏感性的关系;第二部分,DNA修复在EZH2调控GBM对TMZ敏感性中的作用。第一部分EZH2表达水平与GBM对TMZ化疗敏感性强弱的关系目的:研究EZH2与胶质瘤化疗敏感性之间的关系,验证EZH2敲减后的GBM细胞株对TMZ化疗敏感性的变化。方法:分别应用Real-time PCR和Western-blot方法检测EZH2在U87、U251、T98中的m RNA和蛋白表达水平,并应用CCK-8法检测U87、U251、T98对TMZ的IC50值的不同。构建EZH2干扰的慢病毒载体并转染GBM细胞株,用流式细胞学鉴定转染率,RT-PCR和Western-blot方法鉴定EZH2的m RNA和蛋白的敲减效率,并用CCK-8法检测敲减EZH2后的细胞株对TMZ敏感性的变化。结果:EZH2的m RNA表达水平依次为U251T98U87,U251与T98之间未达到统计学差异(P0.05),U87分别与U251和T98两两之间达到统计学差异(P0.05)。EZH2的蛋白表达水平与其m RNA表达水平高低顺序基本相同。U251、T98和U87经替莫唑胺处理后测得其IC50值依次降低,U251与T98之间无明显差异(P0.05),U87与U251之间有显著差异(P0.05),U87与T98之间有显著差异(P0.05)。慢病毒转染细胞U87、U251细胞株后的转染率经流式细胞术测得均达99%以上,其相应的EZH2蛋白敲减效率分别达95%和50%。在U87、U251中,敲减EZH2的细胞株对TMZ的IC50值相较于未敲减株明显降低(P0.05)。结论:EZH2的高表达使GBM细胞对替莫唑胺的敏感性减弱,敲减EZH2后,U87和U251细胞对TMZ的敏感性均明显增强。第二部分DNA修复途径在EZH2调控的GBM对TMZ敏感性中的作用目的:研究EZH2基因敲减后的DNA修复水平变化及与GBM对TMZ敏感性变化的关系。方法:建立EZH2敲减的U87、U251细胞株,通过western-blot检测其MGMT、MSH2、MSH6、ERCC1、XRCC1、PARP1蛋白表达水平的变化,并通过抑制PARP1后用CCK-8法检测U87、U251(si-EZH2)细胞株对TMZ的IC50值变化。结果:敲减EZH2的U87细胞株的XRCC1、MSH2、MSH6、PARP1蛋白表达水平较未敲减组明显降低(P0.05)。而敲减EZH2的U251细胞株MGMT、PARP1蛋白表达水平较未敲减组明显降低(P0.05)。U87和U251细胞株的si-EZH2+PARP1 i组的IC50值均较si-EZH2组明显降低(P0.05),PARP1 i组较正常对照组IC50值明显降低(P0.05),但其与si-EZH2组比较未见明显变化(P0.05)。经TMZ诱导后U87、U251的PARP1蛋白水平随着加药时间的延长有所上升且未敲减EZH2组的PARP1蛋白水平较敲减组上升的更为明显(P0.05)。研究结果说明:DNA修复蛋白PARP1受抑制后,U87、U251细胞对TMZ的敏感性明显增加;同时敲减EZH2和抑制PARP1后的U87、U251对TMZ敏感性增加最明显,且随着TMZ诱导时间的延长,未敲减组的PARP1蛋白水平较敲减组有明显的增加。结论:EZH2蛋白表达水平可影响相关DNA修复蛋白表达水平,提示EZH2基因可能参与了DNA修复的过程。EZH2通过调控PARP1表达水平可能是EZH2影响胶质瘤细胞对TMZ的敏感性的分子机理之一。
【关键词】：胶质瘤细胞 替莫唑胺 U251 U87 T98 DNA修复 PARP1 敏感性
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 第一部分 研究EZH2表达水平高低与GBM对TMZ的敏感性之间的关系12-38
• 前言12-13
• 一、实验材料与方法13-25
• 二、实验结果25-34
• 三、讨论34-38
• 第二部分 DNA修复在EZH2调控的胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用38-47
• 前言38-40
• 一、实验材料与方法40-41
• 二、实验结果41-45
• 三、讨论45-47
• 参考文献47-51
• 全文总结51-52
• 综述52-65
• 参考文献58-65
• 硕士期间发表论文及参加学术会议情况65-66
• 致谢66

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王东;;基于DNA损伤修复的分子靶向治疗:肿瘤靶向治疗的新篇章[J];第三军医大学学报;2014年22期

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本文编号：354214