癫痫病人诱导多能干细胞来源的神经元中Nav1.1突变效应及其致病机理研究

发布时间：2022-11-01 22:22

　　SCN1A是编码电压门控钠离子通道Nav1.1的a亚基的基因。临床上检测到的该基因突变会导致Nav1.1功能呈现增强、或丧失两种截然相反的改变。尽管利用不同体系对该基因突变造成癫痫病因的研究已持续了几十年之久,但至今对此问题仍无确定答案。部分原因在于以往使用的研究体系本身具有局限性,因此,在本课题中,我们将CRISPR/Cas9及TALEN介导的基因编辑技术应用到iPSC的癫痫模型中,来研究SCN1A功能丧失型突变导致癫痫的病因。通过在iPS细胞水平上敲入红色荧光蛋白基因tdTomato来标记神经元网络中的GABA能神经元亚型,我们首次在病人来源的神经元网络中对表达Nav1.1的神经元亚型做了电生理检测。同时,我们对网络中自发抑制性及自发兴奋性突触后电活动进行了分析。首先,我们对来自病人的突变c.A5768G进行了体外转染体系的检测,结果表明该突变在转染细胞中正常表达,但通道无或仅有极小钠电流。对该病人iPS细胞分化得到的神经网络中的GABA能神经元进行电生理研究发现,c.A5768G突变不仅使神经元上Nav的通道电流降低,同时会使Nav的激活曲线右移。而Nav通道的改变进一步使GAB... 

【文章页数】：107 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 癫痫概述
        1.2.1 癫痫发作的分类
        1.2.2 癫痫的病因
        1.2.3 癫痫的治疗
    1.3 离子通道概述
        1.3.1 电压门控的离子通道
        1.3.2 配体门控的离子通道
    1.4 膜片钳技术概述
        1.4.1 膜片钳技术的基本应用
    1.5 诱导多能干细胞技术概述
        1.5.1 诱导多能干细胞技术的发展
        1.5.2 诱导多能干细胞技术的应用
    1.6 基因编辑技术概述
        1.6.1 基因编辑技术发展简史
        1.6.2 基因编辑技术的应用
    1.7 Nav1.1突变导致癫痫概述
        1.7.1 Nav1.1突变类型与突变效应的关系
        1.7.2 Nav1.1在大脑中的表达
        1.7.3 SCN1A突变造成癫痫的机制研究
    1.8 课题概述
        1.8.1 研究方法与实验设计
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 本课题使用质粒
        2.1.2 本课题涉及的细胞株
        2.1.3 仪器
        2.1.4 电生理实验相关试剂、药品
        2.1.5 细胞培养相关试剂
        2.1.6 试剂盒、工具酶
        2.1.7 其他
    2.2 实验方法
        2.2.1 病人iPS细胞重编程
        2.2.2 iPS细胞培养
        2.2.3 iPS细胞多能性鉴定
        2.2.4 TALEN介导的基因修复
        2.2.5 CRISPR/Cas9介导的基因敲入
        2.2.6 体外诱导神经元分化
        2.2.7 Nav1.1的外源转染
        2.2.8 电生理实验
        2.2.9 蛋白提取和Western blot实验
        2.2.10 免疫荧光实验
        2.2.11 流式细胞分选实验
        2.2.12 数据分析
第三章 结果与讨论
    3.1 结果
        3.1.1 癫痫病人描述
        3.1.2 癫痫病人突变效应鉴定
        3.1.3 病人iPS细胞的重编程及修复
        3.1.4 神经元的诱导分化
        3.1.5 CRISPR/Cas9介导的tdTomato基因敲入
        3.1.6 Nav1.1离子通道主要表达在tdTomato阳性的GABA能神经元中
        3.1.7 病人来源的tdTomato阳性GABA能神经元中钠通道功能改变
        3.1.8 癫痫病人来源的GABA能神经元动作电位发放能力变弱
        3.1.9 神经元网络中自发突触后电流分析
        3.1.10 神经元网络中Nav1.1总蛋白表达量分析
    3.2 讨论
    3.3 结论
参考文献
附录
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3700204