脑动静脉畸形内皮细胞体外培养模型的建立

发布时间：2017-06-20 22:05

  本文关键词：脑动静脉畸形内皮细胞体外培养模型的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:脑动静脉畸形(cerebral arteriovenous malformations,cAVM)是常见的颅内血管性病变,是由动脉、静脉及动脉化的静脉组成的畸形的血管团。在胚胎早期,原始的动脉及静脉是直接沟通的,以后由于局部毛细血管发育异常,动脉及静脉仍然以直接沟通的形式遗留下来。临床表现主要为反复发作的脑出血,其致残率、致死率极高。在以往的研究中发现,cAVM的病理性改变与供血动脉压力、畸形团、引流静脉、血流速度和盗血现象相关。其畸形血管团暴露在异常的高血流和剪切力下,会激活平滑肌细胞和大脑内皮细胞的分子通路,导致内皮细胞、平滑肌细胞增殖和血管重构。动物模型显示,畸形血管团的病理改变包括:血管壁不同程度的增厚、弹力层的断裂,内皮细胞层的增厚,内皮细胞间粘附连接的缺失,内皮细胞连续不完整和丝状伪足的缺乏。血管内皮细胞作为cAVM形成机制的首要参与者,在cAVM的形成过程中起着至关重要的作用。找到高效、简便的血管内皮细胞原代培养的方法,建立血管内皮细胞培养模型,是研究cAVM的形成机制的基础。方法:选取经核磁共振(The Magnetic Resonance Imaging,MRI)、血管造影(Digital Subtraction angiography,DSA)及手术病理切片明确诊断脑动静脉畸形的患者10例,癫痫患者颞浅静脉3例。以上标本均来自于北京天坛医院经手术治疗的患者。上述标本首先采用组织免疫荧光进行von Willebrand Factor(vWF)and a-smooth muscle action(a-SMA)抗体染色。剩余标本通过胶原酶消化法进行原代细胞培养。经流式细胞术对原代培养的细胞进行分选,筛选出Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,(PECAM-1/CD31)及CD144双阳性细胞继续培养。分选后细胞在倒置显微镜下观察细胞生长形态,再经流式细胞术鉴定内皮细胞纯度。将分选后的内皮细胞经细胞免疫荧光对CD31、CD144、vWF及α-SMA染色。测定内皮细胞对Acetylated Low Density Lipoprotein labeled with 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate(Dil-Ac LDL)的吞噬能力,进一步证实经该实验方法原代培养的细胞为内皮细胞。通过内皮细胞迁移、侵袭及成管实验,对培养的内皮细胞的功能进行评估。比较动静脉畸形患者内皮细胞血管生成能力与正常内皮之间的差异。结果:1一般资料本实验共统计分析了cAVM患者10名,其中男性7例,女性3例。以脑出血为首发症状者7例,合并癫痫病史者有2例。10位患者颅内动静脉畸形病灶体积大小介于40~70mm之间。每位患者均采用手术治疗,手术室取材后,进行血管细胞原代培养,通过上述培养方法进行培养,该实验的成功例数为7例。脑动静脉畸形从MRI及DSA影像学可见动静脉畸形血管团显影。2测定组织的vWF及α-SMA表达。对superficial temporal vein(STV)及cAVM组织行免疫荧光学检测vWF及α-SMA的表达水平,结果所示,在STV及cAVM组可以看出,各组取材均有vWF及α-SMA的表达。vWF定位于内皮细胞,而α-SMA定位于血管平滑肌细胞。3原代细胞培养的分选。通过流式细胞分析仪对原代培养的细胞进行分选,获取CD31及CD144双阳性细胞继续培养。4分选后细胞的形态学观察及流式细胞分析。分选后细胞倒置显微镜下可见,STV及cAVM组细胞为扁圆形或椭圆形,呈铺路石样排列。其中可见cAVM组细胞密度较STV组降低,呈抑制性生长。流式细胞分析结果可看出,该实验方法得到内皮细胞纯度较高,其中cAVM组细胞CD31及CD144双阳性比例为90.60%,STV组CD31及CD144双阳性细胞比例为98.4%。5分选后细胞CD31、CD144、vWF、α-SMA的表达。通过细胞免疫荧光检测STV组及cAVM组细胞CD31、CD144、vWF及α-SMA的表达。从免疫荧光结果可以看出,各组原代培养的细胞均有CD31、CD144及vWF的表达,证实内皮细胞的纯度。6分选后细胞Dil-Ac LDL吞噬实验。从结果可以看出,STV组及cAVM组分选后培养细胞均有摄取脂质的能力,进一步证实该实验中原代培养细胞为内皮细胞。7内皮细胞的体外成管实验将cAVM和STV组内皮细胞行体外成管实验。结果显示:cAVM组成管长度明显低于STV对照组,cAVM组原代培养细胞成管长度为12.58±0.30 mm/mm2,STV组原代培养细胞成管长度为22.42±0.86mm/mm2(P0.05,n=3)。8内皮细胞体外迁移力和侵袭力差异表现内皮细胞迁移和侵袭实验中,cAVM内皮细胞迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,与STV对照组比较,有显著的差异(P0.05)。其中cAVM内皮细胞迁移个数为596.50±29.07,STV内皮细胞迁移个数为28.42±8.56。而在细胞侵袭实验中,可以得出cAVM内皮细胞侵袭细胞计数为375.56±24.49,STV内皮细胞侵袭个数为31.50±3.76。说明cAVM组的内皮细胞迁移和侵袭能力均较正常对照组明显下降。结论:通过胶原酶消化法及流式细胞学分选行原代内皮细胞培养是获取cAVM内皮细胞的有效方法,成功率高,可靠性大,可以构建体外研究cAVM血管内皮细胞的模型。证实了在cAVM组内皮细胞的成管、迁移及侵袭能力明显降低。因此,内皮细胞功能的下降可能是动静脉畸形血管团形成的机制之一。
【关键词】：脑动静脉畸形(cAVM) 颞浅静脉 原代内皮细胞培养 流式细胞术 细胞鉴定
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.4
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-21
• 结果21-23
• 附图23-30
• 附表30-31
• 讨论31-34
• 结论34-35
• 参考文献35-38
• 综述 脑动静脉畸形分子生物学：当前研究现状与未来趋势的回顾38-51
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

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本文编号：466977