马索罗酚对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障的影响及机制研究

发布时间：2017-06-29 09:15

  本文关键词：马索罗酚对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障的影响及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:应用多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)国际上公认的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)小鼠,研究马索罗酚(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)对EAE小鼠血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的影响及相关机制,旨在观察NDGA对EAE小鼠的治疗作用并探究该药物对于EAE小鼠BBB潜在的保护作用及其可能的机制,从而为今后临床应用马索罗酚辅助治疗MS等中枢神经系统自身免疫性疾病提供新的理论依据,寻找临床治疗MS的新靶点。方法:将66只8-10周雌性近交系C57BL/6小鼠(体重为18-20g),随机分为三组:正常对照组、EAE组、马索罗酚组,其中每组各为22只。各组又分为发病前给药组与发病后给药组两个亚组。其中发病前给药组又分为免疫后第8天组、免疫后第14天组两个亚组,各亚组2只。发病后给药组分为给药第10天组、给药第20天组两个亚组,其中给药后第10天组6只,给药后第20天组12只。免疫小鼠时应用生理盐水将抗原MOG35-55稀释成为5mg/ml后,将完全弗氏佐剂(结核杆菌的终浓度为4mg/ml)按同等体积加入,混合均匀,充分乳化,将小鼠用乙醚麻醉后,固定小鼠,在小鼠脊柱两侧分四点进行皮下注射,每个点注射0.025ml,总共0.1ml。于免疫当天的第0h及第48h分两次给每只小鼠腹腔注射500ng PTX(1000ng/只)。空白对照组不予免疫。将免疫当天记为第0天,发病前给药组自免疫第0天开始给予药物干预,给予NDGA组每只小鼠NDGA 10mg/kg每日腹腔注射;给予EAE组及正常对照组小鼠5%DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。发病后给药组待每组动物发病达1分(15分法)后开始给予NDGA组的每只小鼠NDGA 10mg/kg每日腹腔注射;给予EAE组及正常对照组的小鼠5%DMSO 10 ml/kg每日腹腔注射。于动物免疫当日及免疫后每日上午8:00与下午17:00对动物体重、活动状况、精神状态以及皮毛光泽度进行观察,并采用国际通用的15分法评分标准分别对各组动物进行神经功能评分。各组小鼠于不同时间点取材后应用荧光显微镜法观察伊文斯兰染色后血脑屏障通透性的改变,应用免疫组织化学法检测小鼠脊髓组织中claudin-5、ZO-1、occludin、MMP-9的表达情况,应用confocal法检测小鼠脑组织中紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1、occludin的表达与定位情况。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测小鼠脊髓组织中MMP-9、NF-κB m RNA水平的改变情况。结果:1神经功能评分正常对照组小鼠均未发病。分别比较给药第10天与给药第20天EAE组与NDGA组中小鼠的神经功能评分均数。在不同时间点NDGA组小鼠的神经功能评分低于EAE组小鼠的神经功能评分,差异有统计学意义(P0.05)。2伊文斯兰染色结果发病前给药组:给药第8天EAE组及NDGA组脊髓组织中可见少许的红色荧光分布于脊膜下,给药第14天EAE组可见大量的红色荧光分布于脊膜下,NDGA组的红色荧光与EAE组相比较分布于脊膜下的较少。而对照组小鼠脊膜下未见明显的荧光分布。发病后给药组:给药10天组中EAE组小鼠脊髓组织中脊膜下的荧光成斑片状分布,且荧光强度高,NDGA组与EAE组相比较,荧光范围较小且强度较弱。给药后第20天,NDGA组与EAE组伊文斯兰无论从渗出的量还是从荧光强度上与给药后第10天组相比较均有不同程度的减少,而NDGA组较EAE组减少得更加明显。3各组小鼠紧密连接蛋白的表达情况3.1 claudin-5表达情况3.1.1免疫组化法检测给药后第20d各组小鼠脊髓组织中claudin-5的表达情况:EAE组小鼠脊髓组织中claudin-5较正常对照组血管内皮中的棕黄色颗粒较少且染色较浅、没有形成连续的血管内皮细胞,NDGA组较EAE组表达明显增多。3.1.2 confocal法检测给药后第20d各组小鼠脑组织中claudin-5的表达情况:正常对照组claudin-5阳性细胞连续分布于血管内皮细胞胞浆中,EAE组与NDGA组claudin-5的连续性遭到破坏,且排列紊乱,但NDGA组较EAE组连续性破坏较轻。3.2 occludin的表达情况3.2.1免疫组化法检测给药后第20d各组小鼠脊髓组织中occludin的表达情况:EAE组小鼠脊髓组织中occludin较正常对照组血管内皮中的棕黄色颗粒较少且染色较浅、没有形成连续的血管内皮细胞,NDGA组较EAE组表达明显增多。3.2.2 confocal法检测给药后第20d各组小鼠脑组织中occludin的表达情况:正常对照组occludin阳性细胞连续分布于血管内皮细胞胞浆中,EAE组与NDGA组occludin的连续性遭到破坏,且排列紊乱,但NDGA组较EAE组紧密连接蛋白的连续性破坏较轻。3.3 ZO-1的表达情况3.3.1免疫组化法检测给药后第20d各组小鼠脊髓组织中ZO-1的表达情况:EAE组小鼠脊髓组织中ZO-1较正常对照组血管内皮中的棕黄色颗粒较少且染色较浅、没有形成连续的血管内皮细胞,NDGA组较EAE组表达明显增多。3.3.2 confocal法检测给药后第20天各组小鼠脑组织中ZO-1的表达情况正常对照组occludin阳性细胞连续分布于血管内皮细胞胞浆中,EAE组与NDGA组occludin的连续性遭到破坏,且排列紊乱,但NDGA组较EAE组紧密连接蛋白的连续性破坏较轻。4各组小鼠MMP-9的表达情况4.1.免疫组化结果显示:在给药后第20天对照组的脊髓组织中均未见明显的MMP-9阳性细胞。EAE组与NDGA组的小鼠脊髓组织均可见MMP-9在脊膜细胞和小血管内皮细胞还有少量在胶质细胞的胞质中呈阳性表达。NDGA组与EAE组相比较,MMP-9阳性细胞中棕黄色颗粒染色较浅,数目较少。4.2 RT-PCR检测给药后第10天、第20天脊髓组织中MMP-9 m RNA水平:与正常对照组相比较,EAE组与NDGA组各个时间的小鼠的MMP-9m RNA水平均有上调,其中NDGA组较EAE组表达水平降低,差异有统计学意义(P0.05)。5各组小鼠NF-κB的表达情况RT-PCR检测给药后第10天、第20天脊髓组织中NF-κB m RNA水平:与正常对照组相比较,EAE组与NDGA组小鼠的NF-κB m RNA水平均有上调,NDGA组较EAE组表达水平减低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1 EAE小鼠发病前期即存在血脑屏障的破坏,且病情越严重,其破坏程度越明显。2马索罗酚可以减轻EAE小鼠疾病进展,保护血脑屏障免遭破坏,其机制可能是通过保护紧密连接蛋白完整性以及抑制MMP-9、NF-κB的表达而发挥作用的。
【关键词】：实验性自身性免疫性脑脊髓炎 多发性硬化 马索罗酚 血脑屏障 紧密连接蛋白
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.5
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文缩写12-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-22
• 结果22-25
• 附图25-31
• 附表31-32
• 讨论32-36
• 结论36
• 参考文献36-39
• 综述 多发性硬化与血脑屏障39-51
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

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