神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响机制的研究

发布时间：2017-09-08 23:13

  本文关键词：神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响机制的研究

  更多相关文章： 人巨细胞病毒 转录激活因子5 人胶质瘤细胞 复制

【摘要】：目的:1、检测人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)基因及转录激活因子5(ATF5)在神经胶质瘤细胞U87、SY5Y及A172中的表达水平,为探讨HCMV在神经胶质瘤细胞中的增殖机制奠定一定的分子生物学基础。2、下调ATF5在神经胶质瘤细胞U87、SY5Y中的表达水平,探讨神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制水平的影响。方法:1、用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞,用相差显微镜观察细胞形态变化。2、用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞分别在24、48、72、96、120 h取各时间点上清液,收集上清后通过空斑定量的方法检测病毒滴度。3、Real-time PCR检测HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表达情况,Western-blot(WB)检测病毒基因编码的蛋白及ATF5表达的情况。4、通过慢病毒为载体的RNA干扰技术,来下调ATF5在胶质瘤细胞U87、SY5Y中的表达,在荧光显微镜下观察慢病毒的感染效率,WB检测ATF5蛋白干扰的效率,选择出最佳感染条件和感染参数。5、下调ATF5在U87、SY5Y细胞中表达后,再用HCMV感染U87、SY5Y细胞,Real-time PCR及WB检测检测HCMV基因及蛋白的表达水平。结果:1、HCMV感染U87、SY5Y、A172后观察细胞形态变化,HCMV感染第3-4天U87、SY5Y细胞形态出现明显的变化,细胞触角由细长变粗钝,细胞由瘦变粗圆,细胞之间变得更为聚合,而A172组细胞则无明显变化。2、HCMV感染U87、SY5Y、A172收集不同时间点的上清,空斑定量检测病毒滴度,其中将U87、SY5Y细胞收集的上清液加入接种HELF的24孔板中,加24、48 h收集的上清液的孔未出现变化,加72 h收集的上清液的孔可检测到空斑且随时间延长空斑数增多,加120 h收集的上清液的孔空斑数量最多病毒滴度最高;而收集A172细胞上清液加入接种HELF的24孔板中则无明显变化。3、Real-time PCR及WB检测显示,HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平与病毒在A172细胞中复制水平相比,U87、SY5Y细胞组明显高于A172细胞组(P0.05),ATF5表达在U87、SY5Y细胞组与A172细胞组相比,U87、SY5Y细胞组ATF5表达明显高于A172组(P0.05)。4、HCMV感染U87、SY5Y两组细胞后,Pearson相关分析结果显示,IE2与ATF5表达具有明显正相关性,U87(r=0.955,P0.05),SY5Y(r=0.956,P0.05)。5、在Complete Medium+5μg/ml Polybrene条件下U87(MOI=1)、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高,在感染后72h时荧光显微镜下可见红色荧光蛋白,转染效率可达95%,WB检测各组ATF5表达,其中U87细胞未处理组、阴性对照CON053组和LV-ATF5-RNAi组ATF5的相对表达量分别为0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03,SY5Y细胞未处理组、阴性对照CON053组和LV-ATF5-RNAi组ATF5的相对表达量分别为0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。6、以慢病毒为载体的RNA干扰技术下调ATF5在U87、SY5Y细胞的表达,用HCMV感染细胞检测HCMV基因以及蛋白的表达水平,结果ATF5表达下调可抑制HCMV的复制(P0.05)。结论:1、HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平高于HCMV在A172细胞中的复制水平。2、ATF5在U87、SY5Y细胞中表达水平均高于ATF5在A172细胞中表达水平,推断HCMV在神经胶质瘤细胞中复制水平可能与ATF5表达水平相关。3、下调ATF5在神经胶质瘤细胞中表达水平可以抑制HCMV的复制。
【关键词】：人巨细胞病毒 转录激活因子5 人胶质瘤细胞 复制
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 材料10-13
• 1.1 主要实验仪器与设备10
• 1.2 主要试验试剂及配制10-12
• 1.3 细胞及病毒来源12-13
• 第二章 方法13-24
• 2.1 细胞的获取与培养13-15
• 2.2 HCMV AD169毒株的制备和定量15-16
• 2.3 HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172和HELF细胞16
• 2.4 Real-time PCR分别检测HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172前后IE2、UL44、UL99及ATF5基因表达水平的变化16-19
• 2.5 WB分别检测HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172前后IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白表达水平的变化19-22
• 2.6 慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染神经胶质瘤U87和SY5Y细胞22
• 2.7 Real-time PCR检测干扰ATF5表达后病毒在胶质瘤细胞中mRNA表达水平的变化22-23
• 2.8 WB检测干扰ATF5表达后病毒在胶质瘤细胞中蛋白表达水平的变化23
• 2.9 统计学方法23-24
• 第三章 结果24-41
• 3.1 细胞培养24
• 3.2 HCMV AD169毒株定量24
• 3.3 HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172及HELF细胞其形态学变化和病毒滴度测定24-26
• 3.4 Real-time PCR检测HCMV AD169感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5基因的表达26-28
• 3.5 West-blot检测HCMV AD169感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白的表达28-31
• 3.6 慢病毒感染U87、SY5Y细胞效率检测31-32
• 3.7 慢病毒对ATF5干扰效率的检测32-34
• 3.8 干扰ATF5在表达后病毒在胶质瘤细胞中mRNA表达水平的变化34-36
• 3.9 干扰ATF5表达病后病毒在胶质瘤细胞中蛋白表达水平的变化36-41
• 第四章 讨论41-43
• 第五章 结论43-44
• 参考文献44-46
• 文献综述46-55
• 参考文献52-55
• 攻读学位期间研究成果55-56
• 致谢56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 WU LianQiu;ZHANG XueMei;CHE YanChun;ZHANG Ying;TANG SongQing;LIAO Yun;NA RuiXiong;XIONG XiangLin;LIU LongDing;LI QiHan;;A cellular response protein induced during HSV-1 infection inhibits viral replication by interacting with ATF5[J];Science China(Life Sciences);2013年12期

，

本文编号：816888