VASP磷酸化对细胞迁移的影响及其调控机制

发布时间：2018-05-29 17:36

本文选题：VASP + PDGF　；参考：《武汉大学》2010年博士论文

【摘要】：细胞迁移(Cell migration)参与正常的生理过程,如胚胎的形成、组织修复和再生,也与多种重要病理过程有关,如血管疾病、癌症等。因此,研究细胞迁移的基本机制对相关疾病的治疗十分重要。细胞移动的过程直接以细胞骨架的改建为基础,在肌动蛋白聚合和解聚的反应上发生。血管扩张刺激磷蛋白(Vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP)是PKA的一种重要作用底物,它调节肌动蛋白丝的组装和集聚,在与肌动蛋白骨架调节有关的各种细胞功能中发挥重要作用。但是,VASP磷酸化在细胞迁移中的确切作用还不完全清楚。而且,PKA如何将细胞外信号特异性传递到细胞内VASP从而引起细胞移动呢,其信号通路的具体调节机制尚不明确。最新研究表明,激酶A锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins, AKAPs)介导了PKA信号转导的特异性调节。AKAPs与PKA结合,引导并锚定PKA于细胞内的特定区域,使PKA催化活性充分激活,从而定向地使该处底物磷酸化来发挥特定的生物学效应。WAVE-1是定位于肌动蛋白骨架的一种特殊的AKAPs蛋白,参与了Rac信号介导的板状伪足的形成。因此,我们探讨WAVE-1锚定结合PKA对细胞迁移的影响及对PKA-VASP信号途径的调节作用。本研究以VASP磷酸化在PDGF诱导细胞迁移中的调节作用为切入点,采用离体细胞实验和在体动物模型,观察WAVE-1对PKA-VASP通路的调控,旨在进一步明确VASP磷酸化对细胞迁移的确切机制,为细胞移动障碍相关疾病的治疗提供理论依据和新的治疗靶点。具体研究内容分为以下四个部分。第一部分VASP的磷酸化及其磷酸化位点突变对细胞迁移的影响目的：VASP磷酸化是调节其自身功能的关键环节。VASP有三个磷酸化位点Ser157, Ser239及Thr278,分别受到PKA/PKG的信号调节。这些位点的磷酸化与VASP功能的调节密切相关。本实验通过观察VASP在PDGF诱导细胞迁移中的表达和分布,及VASP Ser157和Ser239位点突变对细胞迁移的影响,探讨VASP磷酸化在细胞迁移中的作用及各磷酸化位点的确切作用。方法：1. PDGF诱导细胞发生迁移,采用细胞划痕损伤实验和Giemsa染色观察迁移情况；采用Western blot法检测VASP总蛋白表达和VASP Ser157磷酸化的表达量;用免疫荧光检测迁移细胞内肌动蛋白骨架和VASP的分布情况。 2.将VASP Ser157和Ser239磷酸化位点突变体及VASP对照质粒分别用脂质体转染ECV304细胞株,转染24-48小时后用Western blot法分别检测VASP磷酸化位点突变效果,通过transwell小室跨膜迁移实验观察各实验组对PDGF诱导20h后细胞迁移的影响。结果：1.PDGF诱导细胞向划痕区域发生明显迁移,迁移前缘的细胞向前方伸长,形成宽大的细胞突起结构。免疫荧光检测发现,PDGF刺激细胞骨架发生重排,细胞内出现粗大的肌动蛋白纤维丝,主要分布于沿迁移方向伸出的片状伪足上。VASP也由散在的点状分布转移到肌动蛋白纤维丝的末端,大部分聚集在细胞片状伪足的前缘。迁移细胞内VASP的总蛋白表达增加,VASP Ser157磷酸化水平增高。 2.转染VASP Ser157位点突变体的ECV304细胞内,VASP Ser157磷酸化表达显著减少,VASP Ser239磷酸化表达无明显变化。转染VASP Ser239位点突变体的ECV304细胞内,VASP Ser239磷酸化表达显著减少,VASP Ser157磷酸化表达无明显变化。跨膜迁移实验结果显示,分别转染这两种突变体的ECV304细胞跨膜迁移的数量都明显减少,但VASP Ser157突变体转染组与Ser239突变体转染组的的迁移细胞数量无明显差异性。结论：1.VASP磷酸化正向调控细胞迁移2.VASP Ser157和Ser239位点磷酸化均介导细胞迁移。第二部分PKA和AKAP对PDGF诱导的细胞迁移的调控作用目的：本实验通过抑制AKAP与PKA的结合及PKA活性对PDGF诱导的细胞骨架和细胞迁移的影响,旨在探讨AKAP和PKA对PKA-VASP信号途径及细胞迁移的调节作用。方法：将ECV304细胞分为四组：空白对照组,PDGF诱导迁移组(PDGF), PKARⅡ-AKAP特异性结合抑制剂St-Ht31+PDGF组,PKA选择性抑制剂H-89+PDGF组。采用细胞划痕损伤实验观察细胞迁移,用非放射性酶法检测PKA活性,采用western blot检测VASP Ser157磷酸化的表达量。用免疫荧光检测各组细胞肌动蛋白骨架和VASP的分布情况。结果：1.PDGF诱导ECV304细胞发生明显的迁移。经PDGF处理的细胞PKA活性增强,VASP Ser157磷酸化水平增高。PKA选择性抑制剂H-89能显著抑制PDGF诱导的细胞迁移,抑制PKA活性,降低VASP Ser157磷酸化水平。PKARⅡ-AKAP特异性结合抑制剂St-Ht31也能显著抑制PDGF诱导的细胞迁移,降低PKA活性,降低VASP Ser157磷酸化。 2.免疫荧光检测发现预先用AKAP-PKA结合抑制剂St-Ht31处理后再用PDGF刺激细胞,细胞内没有片状伪足形成,肌动蛋白纤维丝明显减少,但仍有少量肌动蛋白纤维丝向不同方向伸展。VASP呈现散在分布,部分VASP分布在肌动蛋白纤维丝的末端。而预先用PKA活性抑制剂H-89处理后再用PDGF刺激的细胞内,细胞骨架被破坏,肌动蛋白纤维丝基本消失。VASP表达量明显减少,零星地散在分布于细胞浆中。结论：1.抑制PKA活性可破坏细胞骨架,抑制PDGF诱导的细胞迁移。2.抑制AKAP和PKA结合可抑制片状伪足形成,抑制PKA活性和VASP磷酸化,从而抑制PDGF诱导的细胞迁移。第三部分WAVE-1对细胞迁移调节机制的探讨目的：WAVE-1蛋白是定位于细胞骨架的一种特殊的AKAP家族成员,它转导细胞外信号并整合PKA与细胞骨架调节分子来调节细胞移动。本实验通过建立WAVE-1稳定过表达细胞株,探讨它对PDGF诱导下细胞迁移的影响及WAVE-1对PKA-VASP信号的转导作用。方法：1.分别将重组质粒pEGFP-C1/WAVE-1和对应空质粒pEGFP-C1通过脂质体转染至人ECV304细胞株,用G418筛选稳定表达细胞株。通过荧光显微镜观察融合蛋白的发光情况,并通过Western blot法检测WAVE-1蛋白的表达变化。 2.将pEGFP-C1稳定转染细胞株(对照组)和WAVE-1稳定过表达细胞株(WAVE-1+组)分别用无血清(静息状态),20ng/ml PDGF 20h及预先加入St-Ht31作用1h再加PDGF处理,通过transwell小室跨膜迁移实验检测两组细胞迁移情况；通过给予不同浓度纤连蛋白检测两组细胞的细胞黏附能力。同时检测各处理因素下两组细胞PKA活性和VASP磷酸化程度。通过免疫荧光观察两组细胞内PKA的分布情况。 3.将VASP Ser157和Ser239磷酸化位点突变体分别瞬时转染至对照组和WAVE-1+组,通过跨膜迁移实验观察PDGF诱导下细胞迁移的改变。结果：1.荧光显微镜下观察发现,WAVE-1稳定过表达细胞株中细胞发光率大于80%。Western blot显示对照组在分子量110kD处无蛋白条带出现,而WAVE-1稳定表达细胞株中WAVE-1蛋白在该处的表达量显著增加。 2.静息状态下,对照组有少量细胞向跨膜小室下方迁移,而WAVE-1+组跨膜细胞与对照组相比显著减少40%。PDGF刺激后,对照组跨膜细胞数量增加,而WAVE-1+组跨膜细胞数量较其无血清处理时进一步减少20%。St-Ht31干预后,对照组跨膜细胞减少；而此时WAVE-1+细胞数量较PDGF处理时显著增加。结果提示WAVE-1+细胞的自发性迁移能力下降。PDGF抑制WAVE-1+细胞的趋化性迁移,阻断WAVE-1与PKA结合可逆转PDGF对WAVE-1+细胞迁移的抑制效应。 3.对照组和WAVE-1+细胞对纤连蛋白各浓度时的细胞黏附情况皆无明显差异性。 4.静息状态下,WAVE-1+组的PKA活性明显高于对照组。PDGF刺激后,对照组和WAVE-1+组的PKA活性都明显升高,但WAVE-1+组PKA活性显著高于对照组。阻断WAVE-1与PKA结合后两组细胞的PKA活性均有所下降,但WAVE-1+PKA水平仍高于对照组。在各处理因素下WAVE-1+组细胞内PKA水平皆对应高于对照组,表明WAVE-1过度表达有利于促进PKA过度活化。 5.对照组及WAVE-1+组的VASP磷酸化表达的变化趋势与PKA活性变化基本一致。在各处理因素下,WAVE-1+组VASP磷酸化水平皆对应高于对照组,但增高幅度没有PKA活性的变化幅度大。综合PKA活性和VASP表达的结果,表明WAVE-1过度表达,可通过PKA途径增强VASP磷酸化。 6.对照组细胞在静息状态时,PKA在细胞内呈现广泛性的分布,用PDGF刺激后,细胞浆和细胞边缘出现散在点状分布,细胞核仍有表达。而在静息状态时,WAVE-1过度表达的细胞内PKA普遍聚集在核膜周围,呈现明显的“指环状”分布。用PDGF刺激后,PKA从核膜上转移分布到胞浆中,呈现弥散的点状分布,细胞核内基本无PKA表达。 7.VASP Ser157和Ser239位点突变体分别转染到对照组细胞株和WAVE-1+细胞株后,这两组细胞的跨膜迁移数量都明显减少。在对照组细胞中,这两个突变体对细胞迁移的抑制程度相当。在WAVE-1+细胞中,以VASP Ser157突变体的抑制程度为主,而VASP-S239A组对WAVE-1+细胞迁移的抑制程度无统计学差异。结论：1.本研究成功建立人WAVE-1基因稳定过表达细胞株。 2.过度表达WAVE-1可抑制细胞自发性迁移,抑制PDGF诱导的细胞迁移。这些与PKA的过度活化有关。 3.WAVE-1过度表达,增强了PKA活性和VASP磷酸化,这种效应依赖于WAVE-1对PKA的锚定结合。 4.WAVE-1过度表达改变了PKA的亚细胞定位。 5.在WAVE-1过表达细胞内,VASP主要通过Ser157位点磷酸化维持着细胞应对刺激的迁移能力。第四部分2型糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和PKA及VASP的变化目的：本研究建立2型糖尿病大鼠的在体动物模型,观察主动脉粥样硬化(AS)病变中血管平滑肌细胞(VSMC)迁移,探讨VSMC迁移与PKA表达及VASP磷酸化之间的关系,为离体细胞研究寻求在体实验依据。方法：1.将8周龄雄性SPF级SD大鼠随机分为2组：正常对照组(n=10),饲以正常饲料：2型糖尿病模型组(n=12),通过高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(25mg/kg,腹注)复制2型糖尿病大鼠模型,共同饲养8周,检测动物血糖、血脂、血胆固醇、糖基化血红蛋白、血清胰岛素等生化指标。2.取大鼠主动脉弓进行实验,通过HE染色、透射电镜观察血管病变和VSMC的迁移情况；通过免疫组织化学法检测VSMC、PKA和磷酸化的VASP在病变区域的表达和分布。结果：1.各项血液指标的结果显示DM组大鼠出现明显高血糖、高糖基血红蛋白、高胆固醇和胰岛素抵抗的特征。 2.正常大鼠主动脉各层结构正常,中膜VSMC排列整齐、与弹力纤维近似平行相间排列。DM组主动脉横断面上可见中膜增厚病灶,向血管腔内突起。其中弹力纤维层次增多,增厚紊乱,大量胶原增生,并且网罗大量VSMC。VSMC显著增生、泡沫化,排列紊乱。VSMC向内膜方向聚集,部分VSMC穿过内弹力板向内膜下迁移。内弹力板厚薄不均,有断裂分离现象。 3.正常大鼠主动脉壁中PKA表达极少,散在分布在中膜VSMC内,着色部位主要在细胞浆,呈弱阳性表达。而2型糖尿病大鼠模型组PKA在中膜VSMC内表达呈强阳性；并且PKA阳性表达的细胞增多,广泛分布于血管中膜的浅层,在向内膜迁移的VSMC分布区域也有大量聚集。 4.正常大鼠主动脉壁中磷酸化的VASP散在表达在中膜外层VSMC内,着色部位主要在细胞浆,呈弱阳性表达。而2型糖尿病大鼠模型组中磷酸化VASP在VSMC内表达呈强阳性。VASP阳性表达的细胞聚集在向内膜迁移的VSMC分布区域,内膜下也有明显表达。结论： 1.2型糖尿病大鼠动脉粥样硬化病灶部位存在VSMC的迁移。 2.2型糖尿病大鼠主动脉内细胞迁移部位存在PKA和VASP磷酸化表达增强。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363.1

【参考文献】