CTLA-4单链抗体与HBsAg共修饰的DC疫苗抗HBV免疫的研究

发布时间：2018-06-02 06:18

本文选题：乙型肝炎病毒 + 树突状细胞　；参考：《浙江大学》2008年博士论文

【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是引起病毒性肝炎的主要致病因子。T细胞免疫应答被认为是机体清除HBV感染的主要机制,而T细胞介导的免疫反应也与肝脏的病理损伤密切相关。大量研究表明,急性自限性HBV感染者伴随有高效、多克隆、特异性的CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞反应;而在慢性乙肝患者,这种免疫应答的程度较弱甚至无法检测。抗原递呈细胞是激发机体免疫反应的首要环节,树突状细胞(DC)是已知递呈功能最强的抗原递呈细胞。HBV的免疫清除依赖于HBV特异性T细胞反应的激活,而HBV特异性免疫应答的建立依赖于DC功能的健全。然而,慢性乙肝患者的DC细胞存在功能缺陷。此外,HBV感染人体肝细胞后,在抗原递呈细胞递呈病毒抗原、激活T细胞的过程中,除抗原及MHC-TCR信号外,共刺激信号B7/CD28途径是T细胞活化的第二信号。而B7/CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4)是目前肯定的负性免疫共刺激信号,被认为是维持外周T细胞耐受的一种重要机制,CTLA-4信号的阻断有助于增强抗原特异性的T细胞免疫应答。因此,通过具有较低免疫原性的单链抗体封闭CTLA-4受体进而阻断CTLA-4/B7共抑制通路,联合提高慢性感染者DC功能的策略,可最大程度地增强抗HBV的细胞免疫应答,更为有效地清除HBV的持续感染。 HBV转基因小鼠(Transgenic mice,Tg)是一种持续HBV感染模型,包含完整HBV基因组并表达其病毒基因产物,在肝细胞内复制病毒,但肝脏无炎症表现,对HBV病毒抗原耐受且无特异性T细胞应答,是评价打破耐受和结束HBV持续感染的免疫治疗策略的良好实验模型。对HBV Tg鼠的研究发现,HBsAg蛋白或肽冲击的DC疫苗在诱导特异性CTL方面比重组HBsAg或质粒DNA疫苗明显增强,但其作用还不足以抑制HBV DNA复制。另外,本课题组前期研究发现,携带HBsAg基因的重组腺病毒转导的DC比抗原蛋白冲击的DC疫苗能诱导更强的抗病毒CTL应答,但抗体水平和维持作用时间较为有限。因此,还需更有效的免疫策略刺激足够强与足够长时程的免疫应答,以获得更为强大持久的抗病毒免疫效果。本研究通过构建小鼠CTLA-4的单链抗体ScFv,以及ScFv与HBsAg融合表达的重组腺病毒载体Ad-S-ScFv,体外转染小鼠骨髓来源的DC并观察其体外免疫刺激活性。同时,研究和评价该DC疫苗在HBV转基因小鼠中诱导抗HBV免疫的作用特点、分子机制及其对HBV持续感染的可能治疗作用,为该疫苗应用于慢性HBV持续感染的治疗提供实验和理论依据。本研究共分三个部分。第一部分CTLA-4单链抗体ScFv,及HBsAg-ScFv融合表达真核质粒的构建、蛋白纯化与亲合力分析研究目的克隆小鼠CTLA-4单链抗体(ScFv),构建能稳定表达ScFv及HBsAg-ScFv(S-ScFv)的真核质粒载体,对表达的目的蛋白进行纯化及亲合力测定。研究方法复苏并亚克隆分泌CTLA-4单抗的杂交瘤细胞株4F10并获得高滴度细胞株,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增该抗体的VH和VL基因,T-A克隆并测序分析。根据VH_(4F10)、VL_(4F10)、(G4S)_3基因序列以及载体多克隆位点内切酶的核酸序列设计引物,通过重叠延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增到ScFv_(4F10)基因,测序核实后分别克隆到pSectag2B空载体和pSectag2B-S中,成功构建真核分泌型表达载体pSect2/ScFv_(4F10)和pSect2/S-ScFv_(4F10)。上述载体转染中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞,Western鉴定目的蛋白的表达;成功表达的蛋白经超滤浓缩与亲和层析纯化后,分别通过竞争抑制酶联免疫吸附实验(ELISA)和表面等离子共振(SPR)技术,检测其与重组小鼠CTLA-4抗原的结合活性及亲合常数。研究结果 1.成功克隆了CTLA-4的单链抗体ScFv_(4F10),VL基因全长339bps,VH基因全长345bps,分别编码113和115个氨基酸残基。互联网在线分析结果表明:VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为特征性半胱氨酸;VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为特征性半胱氨酸。 2.成功构建了可稳定表达ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的真核质粒载体,蛋白印迹表明其表达的蛋白分别约28 KDa和52 KDa。 3.纯化的ScFv_(4F10)、S-ScFv_(4F10)蛋白均能竞争抑制CTLA-4亲本单抗与重组CTLA-4抗原的结合;亲本单抗、ScFv_(4F10)、S-ScFv_(4F10)与重组CTLA-4抗原的亲合常数KA值分别为7.29×10~8M~(-1),9.52×10~6 M~(-1)和2.04×10~6 M~(-1)。研究结论 1.成功克隆了小鼠CTLA-4的单链抗体ScFv_(4F10); 2.成功构建了能高效表达ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的真核质粒载体pSect2/ScFv_(4F10)和pSect2/S-ScFv_(4F10); 3.纯化了真核质粒载体pSect2/ScFv_(4F10)、pSect2/S-ScFv转染CHO细胞所分泌表达的目的蛋白,验证了其与CTLA-4抗原具有较高的结合活性。第二部分 ScFv,S-ScFv的重组腺病毒载体构建、鉴定与体外活性分析研究目的构建能高效转导ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,体外感染小鼠骨髓DC并分析其表型及免疫刺激活性。研究方法应用AdEasy~(TM)XL腺病毒载体系统分别构建表达ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的重组腺病毒Ad-ScFv和Ad-S-ScFv。病毒颗粒在AD293细胞中进一步扩增,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。流式细胞术分析对照Ad-GFP转染DC的荧光表达效率,Western检测ScFv和S-ScFv在DC中的表达。BALB/c(H-2~d)小鼠的骨髓细胞体外与GM-CSF、IL-4和TNF-α共培养7天,形成小鼠骨髓来源的DC,转染重组腺病毒(Ad-ScFv、Ad-S-ScFv或Ad-S、Ad-lacZ)用于体外实验。流式细胞术分析腺病毒转染DC的表型和吞噬抗原能力,ELISA分析IL-12的分泌水平,同种异体和自体混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC的刺激活性,并以流式细胞术分析自体MLR中增殖T细胞内的细胞因子产量。研究结果 1.PCR和测序分析显示,穿梭载体和重组腺病毒质粒均含有完整的ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)基因序列。Western鉴定了ScFv、S-ScFv蛋白的正确表达。 2.通过Reed-Muench法测定第二代重组腺病毒滴度(TCID 50/mL),结果Ad-ScFv、Ad-S-ScFv均达10~8/ml。 3.对照Ad-GFP以MOI为100转染小鼠骨髓来源的DC细胞,用流式细胞仪检测转染效率为95.05±3.05(%),荧光强度(MnX)达215.85±53.05。 4.流式细胞术分析表明,DC/Ad-ScFv、DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S、DC/Ad-lacZ和未处理DC,表面CDllc、DEC-205、MHCⅠ类和Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40、CD54等表达增强,为成熟DC表型,且各组间没有显著性差异。各组r Ad/DC均能一定程度地吞噬OVA卵白蛋白,且均能分泌一定量的IL-12,但各组间没有显著性差异。 5.无论是同种异体还是自体MLR,各组DC刺激T细胞增殖的功能没有显著性差异。经DC刺激后,自体MLR中CD3~+CD8~-Th和CD3~+CD8~+Tc细胞均以分泌IFN-γ为主,表现为Th1/Tc1型。DC/Ad-S-ScFv组刺激IFN-γ的分泌水平最高,而其余各组DC的这种作用无显著性差异。研究结论 1.成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad-ScFv、Ad-S-ScFv),且能高效转染DC细胞并有效表达目的蛋白。 2.证实Ad-ScFv、Ad-S-ScFv体外转导小鼠骨髓DC后,不影响DC的表型成熟、抗原吞噬和IL-12分泌能力。 3.与其余各组DC相比,Ad-S-ScFv转导的DC刺激同种异体和自体T细胞增殖活性的能力相当,但其诱导Th1/Tc1(Ⅰ型)细胞因子应答的作用更为明显。第三部分Ad-S-ScFv修饰的树突状细胞诱导HBV转基因小鼠抗HBV免疫的研究研究目的以Ad-S、Ad-ScFv转导DC(DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv)为对照,探讨Ad-S-ScFv转导的DC(DC/Ad-S-ScFv)诱导HBV转基因小鼠抗HBV免疫的作用特点、相关分子机制及其对HBV持续感染的可能治疗作用和应用前景。研究方法 DC免疫,1×10~6DC细胞/50μl/只,Tg鼠尾静脉注射,PBS对照(3只),未处理DC对照(3只),DC/Ad-S(10只),DC/Ad-ScFv(10只),DC/Ad-S-ScFv(10只),rAd对照DC/Ad-lacZ(3只);DNA免疫,100μg/50μl/只,双后肢肌肉多点注射,pcDNA3.1(+)-S(9只),pcDNA3.1(+)对照(3只)。间隔3周后再相同免疫一次;anti-PD-L1注射组(9只),五天一次腹腔注射,连续四次。流式细胞术检测免疫后Tg鼠脾脏T细胞内HBsAg特异性IFN-γ~+CD8~+T细胞的比例,ELISA法检测脾细胞HBsAg特异性IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌水平。CFSE掺入法测定脾细胞HBsAg特异性的T细胞增殖与CTL杀伤活性,ELISA检测血清HBsAg、抗-HBs水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA滴度,常规生化法检测血清ALT水平。病理切片常规HE染色分析肝脏及其它多个脏器的炎症情况,免疫组化分析肝组织HBsAg和HBcAg的表达。蛋白印迹检测MAPK与PI3K/Akt两条细胞内信号通路相关蛋白的表达与磷酸化水平。研究结果 1.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1组诱导HBsAg特异性CD8~+T细胞产生IFN-γ的能力显著增强(p＜0.05或p＜0.01),且能诱导更强的HBsAg特异性CTL应答(效靶比为10:1、20:1、40:1时,p均＜0.01)。而与其余各组相比,DC/Ad-S组诱导CD8~+T细胞产生IFN-γ和HBsAg特异性CTL应答的能力也明显增强(p均＜0.05)。 2.免疫后4周,DC/Ad-S-ScFv组比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1组诱导HBsAg特异性CD8~+T细胞产生IFN-γ,以及CTL应答的能力仍强(p＜0.05或p＜0.01)。而与其余各组相比,DC/Ad-S组诱导产生IFN-γ和HBsAg特异性CTL应答的能力无显著性差异(p均＞0.05)。 3.DC/Ad-S-ScFv组免疫后2周和4周,诱导Tc产生IFN-γ能力及CTL反应差异均不明显,但免疫后8周时均明显减弱。而DC/Ad-S免疫后4周与2周时相比,其CTL反应及IFN-γ水平明显减弱(p均＜0.01),免疫后8周时已处于较低水平,且明显低于此时的DC/Ad-S-ScFv组水平。 4.Tg鼠血清HBsAg表达抑制作用最强的为DC/Ad-S-ScFv组,尤其是免疫后4周(2-4-8周平均抑制率分别为29.69%-38.35%-17.76%)。而DC/Ad-S组免疫后4周对HBsAg的抑制已经下降,即存在血清HBsAg水平的回升,pcDNA3.1(+)-S组在免疫后1～4周抑制HBsAg的作用不强但平稳(平均12.05%～14.35%)。 5.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组血清HBV DNA水平迅速下降,且显著低于DC/Ad-S组和pcDNA3.1(+)-S组(p＜0.05,p＜0.01)。免疫后4周,Ad-S-ScFv组血清HBV DNA水平仍较低,且明显低于DC/Ad-S组和pcDNA3.1(+)-S组(p均＜0.01)。各组在免疫后8周的血清HBV DNA水平均有反弹,且各组间比较的差异无统计学意义(p均＞0.05)。 6.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组,pcDNA3.1(+)-S组诱导的抗体分别达(24.55±6.25(mIU/ml))和(30.46±7.88(mIU/ml)),其余各组的抗体水平均较低。除pcDNA3.1(+)-S组外,所有血清(1:2稀释)样本抗体水平在免疫后4周均未达10 mIU/ml以上。 7.免疫后2周和4周的各组血清ALT有轻度增高,但组间差异不明显。免疫后2-8周,除DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S组部分Tg鼠肝实质有较明显的局部炎症浸润外,其余各组的炎症浸润情况多不明显。免疫后第2周和第4周,DC/Ad-S-ScFv组Tg鼠的心肌、胃粘膜、小肠、肾脏及肺组织均未发生自身免疫炎症反应。 8.肝脏免疫组化结果表明,未免疫和PBS对照组Tg鼠肝组织HBcAg表达强阳性,DC/Ad-S-ScFv组在免疫后2-8周有8例(8/10)肝脏HBcAg表达弱阳性;DC/Ad-S组有6例(6/10)肝脏HBcAg表达弱阳性;而DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1(+)-S、anti-PD-L1注射组和DC对照组分别有3例(3/10)、3例(3/9)、1例(1/9)和1例(1/3)HBcAg表达弱阳性。 9.肝脏免疫组化结果表明,未免疫和PBS对照组Tg鼠肝组织HBsAg表达强阳性;DC/Ad-S-ScFv组在免疫后2-8周有7例HBsAg表达弱阳性(7/10);DC/Ad-S有5例HBsAg表达弱阳性(5/10);而pcDNA3.1(+)-S、DC/Ad-ScFv和DC对照组分别有3例、2例和1例HBsAg表达弱阳性。 10.肝组织蛋白印迹表明,DC/Ad-S-ScFv组的MAPK通路的Erk1/2磷酸化水平明显高于其它各组,而Akt蛋白的磷酸化水平在各组间无显著性差异。研究结论 1.DC/Ad-S-ScFv能诱导比DC/Ad-S或DNA疫苗更强的Ⅰ型免疫应答和特异性CTL免疫效应,对HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏组织HBcAg和HBsAg的表达有较迅速和明显的抑制作用,且未引起免疫小鼠的自身免疫炎症反应。 2.DC/Ad-S-ScFv诱导血清抗-HBs的作用仍不强,但在免疫后2周时明显强于Ad-S转导的DC,且与pcDNA3.1(+)-S质粒疫苗的效果相当。 3.DC/Ad-S-ScFv免疫小鼠肝组织蛋白印迹表明,MAPK途径的Erk1/2蛋白磷酸化水平明显增强,提示其进一步激活了TCR下游细胞增殖相关信号通路。 4.DC/Ad-S-ScFv的抗HBV作用在免疫后2周即明显增强,至少维持4周以上,且作用效果明显优于Ad-S转导的DC和DNA疫苗,直到免疫后8周时效果才明显减弱。 5.DC/Ad-S-ScFv是有良好应用前景的HBV持续感染的治疗性疫苗,结合阻断PD-1/PD-L1共抑制途径可能有助于该疫苗进一步增强抗HBV应答的效应。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】