人乳头瘤病毒16型E2蛋白与Daxx相互作用及作用的结构域

发布时间：2018-06-03 00:39

  本文选题：人乳头瘤病毒16型(HPV16) + E2蛋白　； 参考：《南华大学》2013年硕士论文

【摘要】：目的：研究人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白与Daxx的相互作用，为进一步探讨两种蛋白质相互作用在HPV16致癌中的作用及其机制提供实验参考依据。 方法： (1)用PRIMER5.0软件分别设计HPV16E2及其结构域基因片段(氨基酸1-201、202-365和249-365)特异性引物，并引入EcoRI、BamHI酶切位点，PCR扩增目的基因。分别用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物和质粒pGADT7，纯化回收酶切产物，T4连接酶连接后，转化E.coli JM109，筛选阳性克隆。经酶切鉴定及DNA序列分析，构建酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。 (2)应用LiAc法，分别将诱饵质粒pGBKT7/Daxx与猎物质粒pGADT7和pGADT7/HPV16E2转化酵母菌AH109，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade(单缺)固体培养基上，30℃培养2-4d，检测诱饵质粒和猎物质粒对酵母菌AH109的自激活作用。 (3)将质粒分为7组，它们分别是A组(pGADT7+pGBKT7)、B组(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)、C组(pGADT7-T+pGBKT7-p53)、 D组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2)、E组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2TAD)、F组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2H-DBD)和G组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2DBD)。将每组质粒共转化酵母菌AH109，转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu固体培养基，30℃培养2~4d，待平板上长出菌落后，接种单个菌落于SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，30℃培养2~4d，观察酵母菌的生长情况，分析Daxx与HPV16E2相互作用及其氨基酸结构域。 (4)将pcDNA3.1/Daxx用BamHI酶切，收获约2.2kb片段，连入载体pet28a相同位点，筛选阳性克隆，构建6His-Daxx融合蛋白原核细胞表达载体pet28a/Daxx。分别培养E.coli BL21（含pet28a/Daxx或pGEX6p-1/HPV16E2质粒），，IPTG诱导表达目的产物6His-Daxx或GST-HPV16E2，Ni-NTA或GST纯化试验盒分别纯化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定融合蛋白。 (5)取6His-Daxx和GST-HPV16E2融合蛋白纯化产物各0.5μg混合，加入抗GST或抗His抗体及500μl裂解缓冲液，进行免疫共沉淀试验（COIP）和Western blot；培养Caski细胞48h，收集细胞裂解液，经蛋白质A/G琼脂糖处理后，收集上清液，进行COIP和Western blot；IP抗体为抗Daxx或抗HPV16E2抗体，Western blot抗体为抗HPV16E2或抗Daxx抗体。 (6)培养Caski细胞，利用间接免疫荧光试验和图像软件观察并分析HPV16E2蛋白和Daxx在Caski细胞内分布与定位或共定位。 结果： (1) DNA序列分析结果显示HPV16E2及其结构域基因片段均正确地连入pGADT7载体，即构建了酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。 (2)转化了诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7/Daxx的酵母菌AH109，在SD/-Trp固体培养基上可见菌落生长，而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未见菌落生长。转化了猎物质粒pGADT7、pGADT7/HPV16E2的酵母菌AH109，在SD/-Leu固体培养基上可见菌落生长，在SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培养板上未见菌落生长，即诱饵质粒和猎物质粒均无自激活作用。 (3)A～G组质粒转化的酵母菌在SD/-Trp-Leu平板上均可见菌落生长。在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，只有C、D、E组转化菌生长，A、B、F、G组未见菌落生长。 (4)酶切鉴定结果显示，Daxx正确地连入pet28a载体，即构建了Daxx原核表达载体pet28a/Daxx。在E.Coli BL21，IPTG诱导其表达了6His-Daxx融合蛋白。COIP和Westernblot结果显示，在约90kDa与70kDa有条带，即HPV16E2与Daxx在细胞外发生了结合反应。 (5)利用Caski细胞裂解上清液，COIP和Western blot结果显示，在约80kDa与60kDa出现条带，即HPV16E2与Daxx在细胞内发生了结合反应。 (6)在Caski细胞，表达红色信号的HPV16E2和表达绿色信号的Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，少数分布于细胞核；当红色信号与绿色信号重叠时，出现黄色信号。 结论： (1)载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD能在酵母菌中表达相应的目的蛋白；pet28a/Daxx能在E.coliBL21中表达融合蛋白6His-Daxx。 (2) HPV16E2蛋白能在细胞内外结合Daxx；HPV16E2通过N端结构域（TAD）与Daxx结合并发生相互作用。 (3)HPV16E2蛋白与Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，且共定位胞浆与胞核。
[Abstract]:Objective: To study the interaction between human papillomavirus 16 (HPV16) E2 protein and Daxx, and to provide an experimental reference for further exploring the role and mechanism of two protein interactions in the carcinogenesis of HPV16.
Method锛

本文编号：1970794