附睾蛋白酶抑制蛋白的B细胞表位分析及抗生育效应研究

发布时间：2018-06-08 12:25

本文选题：附睾蛋白酶抑制蛋白 + 避孕疫苗　；参考：《第三军医大学》2009年博士论文

【摘要】： 世界人口持续增长的压力和非计划妊娠对生殖健康的危害使人们深刻认识到进一步完善避孕措施的迫切性。目前针对男性的避孕措施仅限于安全套和输精管结扎,前者不够方便,后者不可逆,因而远远不能满足需求。开发更方便、高效、安全、可逆的男性避孕方法成为计划生育研究的重要课题。迄今,男性避孕疫苗候选分子很多,但尚面临避孕效果不理想以及T细胞介导的免疫损伤等局限。针对这两个局限,设计新的疫苗形式和免疫策略实现突破,对开发安全、有效的避孕疫苗具有重要意义。附睾蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor, Eppin)基因的发现为男性避孕疫苗的开发带来了曙光。Eppin蛋白特异表达于睾丸和附睾,在精子成熟中具有重要作用。抗Eppin抗体可直接破坏Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin, Sg)复合体,干扰Eppin调控前列腺特异性抗原对Sg的水解作用,影响精子活动力,进而抑制生育力。利用重组Eppin蛋白免疫雄猴获得了较理想的避孕效果(78%),停止免疫后,71%的受试雄猴恢复了生育力。由此可见,Eppin可望作为男性避孕的有效靶点,但仍需针对男性避孕疫苗存在的上述局限寻求突破。筛选获得Eppin优势中和B细胞表位,并通过免疫小鼠研究其抗生育有效性和安全性是本研究的目的。出于安全考虑,全长蛋白不适于用作疫苗,找出真正抑制生育的关键性表位并增强其免疫原性和避孕效果是关键。基于免疫学基本理论,我们设想,用全长Eppin蛋白免疫,将会产生针对其各个表位的记忆细胞克隆,当只用某个表位肽再次免疫时,则只有针对该表位的记忆细胞被激活、增殖进而分泌抗体。如果初次免疫采用重组人Eppin蛋白(recombinant human Eppin, rhEppin),加强免疫分别采用各候选表位肽,则可以通过所产生的抗体滴度高低来判断该表位是否优势表位;而通过分析被免疫小鼠的生育力抑制效果及其抗血清对精子活力的体外抑制能力,则可判断该表位是否中和性表位。因此,我们拟采用该策略来筛选Eppin的优势中和B细胞表位并研究其抗生育潜能。本研究首先通过RT-PCR法从人新鲜睾丸组织扩增获得Eppin cDNA,构建入原核表达载体,诱导表达并经纯化获得重组人Eppin蛋白(第一部分)。同时,通过计算机软件分析Eppin蛋白二级结构及表面特性,预测出Eppin蛋白的B细胞表位所在区域;并通过与抗血清的结合试验进行初步筛选,得出Eppin候选优势B细胞表位区段(第二部分)。最后,采用rhEppin初次免疫,上述候选表位肽加强免疫的策略,观察各个表位肽刺激抗体产生、抗体对精子活力的抑制能力,以此进一步筛选出其优势中和B细胞表位,并以rhEppin重复免疫为对照,分析其抗生育潜能及安全性(第三部分)。结果发现:①通过分析Eppin蛋白二级结构及表面特性(包括蛋白质的理化性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等),初步预测出Eppin蛋白的B细胞表位区域在第19～31、30～44、58～70、73～85、94～102、103～115、113～124、125～132区段;与抗血清的结合试验发现第58～70、19～31、103～115、113~124区域的抗原性相对较强,从而初步筛选得出了Eppin候选优势B细胞表位(前述四个肽分别命名为肽A～D)。②进一步采用rhEppin初次免疫-候选表位肽加强免疫的筛选策略,发现用四个候选表位肽加强免疫时都能激发产生高滴度的抗体,并维持至8~9个月,而仅B肽、C肽和D肽加强免疫时所获得的抗血清能与人精子天然Eppin蛋白结合,其中仅C肽加强免疫获得的抗血清能显著抑制人精子活力。从而获知Eppin优势中和B细胞表位所在区段为Eppin103-115。③接受rhEppin初次免疫-表位肽C加强免疫的雄鼠(EC组),只能使26.6%的雌鼠受孕,与PBS组(88.9%)相比显著降低,说明雄鼠的生育力受到抑制;而免疫8～9个月后,伴随抗体滴度下降,该组雄鼠能使雌鼠的受孕率达80%,与PBS组(87%)无显著差别,说明避孕作用具有可逆性。④接受rhEppin重复免疫的雄鼠(Eppin组),产生的抗体滴度虽略高于EC组,而抗生育效果两组相当。Eppin组和EC组都只是显著抑制了附睾精子的活力,而性激素水平、精子生成等均未受影响。各组织器官的病理检查也未发现异常。但理论上,采用rhEppin初次免疫-候选表位肽加强免疫策略,产生的抗体更多针对该表位肽,从而更具有安全性。本研究结果表明计算机表位预测结合蛋白初免-表位肽加强免疫策略是筛选蛋白优势中和B细胞表位的有效方法和又一选择;Eppin蛋白的第103-115区段是Eppin优势中和B细胞表位所在区域;rhEppin初次免疫-表位肽C加强免疫策略用于免疫避孕具有较好的安全性和有效性。鉴于Eppin蛋白在人和鼠的遗传差异,尚需在灵长类动物进一步研究证实。
[Abstract]:At present , male contraception is limited to condom and vasectomy , the former is not convenient , the latter is not reversible , thus far unable to meet the need . To date , the male contraceptive vaccine candidate molecule is many , but it is still facing the limitation of contraception effect is not ideal and T cell - mediated immune injury and so on , aiming at these two limitations , designing new vaccine form and immune strategy to achieve breakthrough , has important significance for developing safe and effective contraceptive vaccine .

The discovery of Epidydimal protease inhibitor ( Eosin ) gene has brought a light for the development of male contraceptive vaccine . Eosin protein is expressed specifically in the testis and appendix , which plays an important role in sperm maturation .

For safety reasons , the full - length protein is not suitable for use as a vaccine . It is crucial to find out the key epitopes that truly inhibit fertility and to enhance its immunogenicity and contraceptive effectiveness .

In the first part , the Eosin cDNA was amplified from human fresh testis tissue by RT - PCR . It was constructed into prokaryotic expression vector to induce the expression and purification to obtain recombinant human Eosin protein ( Part I ) . At the same time , the epitope of B cells was predicted by computer software .

The results showed that : ( 1 ) The level of B - cell epitopes was significantly lower than that in PBS group ( 88 . 9 % ) , and the anti - fertility effect was significantly lower than that in PBS group ( 88 . 9 % ) , and the anti - fertility effect was significantly lower than that of PBS group ( 88 . 9 % ) .

The results of this study indicate that the epitope peptide enhanced immune strategy is an effective method and a choice for the selection of epitope of B cells . The 103 - 115 segment of Eosin protein is the region where the epitope of B cells is located ; the primary immunization - epitope peptide C enhanced immune strategy is used in the immune contraception to have better safety and effectiveness .
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】