HBx蛋白表达载体pEYFP-C1-X的构建及对IGF-Ⅱ基因P4启动子活性影响的初步研究

发布时间：2018-06-18 03:21

  本文选题：肝细胞癌 + HBx蛋白　； 参考：《暨南大学》2009年硕士论文

【摘要】： 目的:构建乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)HBx蛋白表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-Ⅱ基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx蛋白对IGF-Ⅱ基因P4启动子活性的影响,为下一步研究HBx蛋白对IGF-Ⅱ基因P4启动子甲基化状态的影响及其细胞信号转导通路奠定基础。 方法:1.以pCMV-tag2B-X的乙型肝炎病毒X基因序列为模板,设计含有限制性内切酶位点EcoRⅠ和SalⅠ的引物,PCR扩增X基因,并将纯化的PCR产物定向克隆入pEYFP-C1质粒的EcoRⅠ-SalⅠ位点,构建成表达HBx蛋白的表达载体pEYFP-C1-X。 2.根据Genbank数据库及相关文献,设计P4启动子片段的巢式PCR引物,以胎肝细胞基因组为模板,PCR扩增P4启动子片段,并将其定向克隆入荧光素酶报告载体pGL3-Basic的KpnⅠ-HindⅢ位点,构建P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4。 3.将pGL3-P4报告载体用SssICpG甲基转移酶孵育,使pGL3-P4甲基化。 4.将重组质粒pEYFP-C1-X转染HepG2和Hela经G418筛选后形成稳定细胞系列后,将体外甲基化pGL3-P4质粒转染上述细胞,并检测P4启动子荧光素酶的活性。 结果:1.经限制性内酶切、PCR反应及测序结果鉴定,证实成功构建pEYFP-C1-X。 2.经限制性内酶切及测序证实成功构建P4启动子的pGL3-Basic真核表达载体。 3.双荧光素酶检测结果初步显示HBx蛋白能增加IGF-ⅡP4启动子活性。 结论:1.本实验成功克隆了HBV X基因,并构建了表达HBx蛋白的真核表达载体pEYFP-C1-X。 2.成功克隆IGF-ⅡP4启动子基因,并构建P4启动子的pGL3-Basic载体。 3.初步显示HBx蛋白能增加IGF-ⅡP4启动子活性。 4.为下一步IGF-ⅡP4启动子低甲基化机制的研究奠定基础。
[Abstract]:Objective: to construct the expression vector pEYFP-C1-X and the luciferase report vector pGL3-P4 regulated by P4 promoter of human IGF- 鈪，

本文编号：2033814