与人类Argonaute2相互作用的DFFA和PSMC3在microRNA作用机制中的功能研究

发布时间：2018-06-19 06:21

  本文选题：Ago2 + DFFA　； 参考：《天津医科大学》2009年硕士论文

【摘要】：目的：RNA干扰是一种由siRNA或dsRNA介导的基因沉默表达的方式。通过与靶mRNA的特异性结合,这些小RNA与Argonaute (Ago)蛋白及相关因子形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),后者完成对靶nRNA的剪切或者翻译抑制。本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到了一系列可能与人类Argonaute2蛋白PIWI结构域相互作用的蛋白,本文在前期工作的基础上选择了其中两个蛋白DFFA、PSMC3进行深入研究,进一步通过免疫共沉淀验证它们与Ago2相互作用的特异性,并研究了这两个蛋白对RNAi的影响,以期进一步深入了解RNAi的机制、探索RNAi可能的调控机制。 方法：利用免疫共沉淀的方法在细胞内验证DFFA、PSMC3同人类Argonaute2蛋白之间相互作用的特异性,构建内源性let-7介导的EGFP-RAS报告系统,通过该系统验证在分别敲除DFFA和PSMC3的情况下,被抑制的EGFP表达效果是否得以增强,间接推测两者在由microRNA介导的RNA干扰过程中的功能。 结果：1.免疫共沉淀证实外源性DFFA和PSMC3同转染的hAgo2PIWI存在着特异的相互作用。进一步的实验证明,只有全长的DFFA和PSMC3Flag融合蛋白才能够将内源的hAgo2蛋白沉淀下来。2.敲除了DFFA、PSMC3对let-7介导的EGFP-RAS报告系统产生抑制作用。 结论：DFFA, PSMC3在体内同Ago2PIWI存在着相互作用；敲除实验证实DFFA、PSMC3均参与了由miRNA介导的RNA干扰过程,推测两者可能是新的RISC组件。
[Abstract]:Objective: RNA interference is a gene silencing expression mediated by siRNA or dsRNA. By specifically binding to the target mRNA, these small RNAs form RNA-induced silencing complexes with Argonaute gogoprotein and related factors, which complete the silencing or translation inhibition of the target nRNAs. A series of proteins which may interact with human Argonaute2 protein domain were screened from human lung cDNA library by yeast two-hybrid system in our laboratory. On the basis of previous work, two of them, DFFA-PSMC3, were selected for further study, and their interaction specificity with Ago2 was further verified by immunoprecipitation, and the effects of these two proteins on RNAi were also studied. In order to further understand the mechanism of RNAi, explore the possible regulation mechanism of RNAi. Methods: the specificity of the interaction between DFFA-PSMC3 and human Argonaute2 protein was verified by immunoprecipitation, and the EGFP-RAS report system mediated by endogenous let-7 was constructed, which was verified by this system when the DFFA and PSMC3 were knocked out, respectively. Whether the inhibition of EGFP expression can be enhanced indirectly infer the function of both in the process of RNA interference mediated by microRNA. The result is 1: 1. Immunoprecipitation showed that exogenous DFFA and PSMC3 had specific interaction with transfected hAgo2 PIWI. Further experiments showed that only the full-length hAgo2 and PSMC3Flag fusion protein could precipitate the endogenous hAgo2 protein. Knockout DFFAP PSMC3 inhibits the EGFP-RAS reporting system mediated by let-7. Conclusion there is interaction between PSMC3 and Ago2PIWI in vivo, and knockout experiments show that PSMC3 is involved in miRNA-mediated RNA interference, suggesting that they may be a new RISC module.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R3416

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本文编号：2038875