幽门螺杆菌微孔蛋白基因hopX的鉴定及分析

发布时间：2018-06-21 12:51

  本文选题：幽门螺杆菌 + 微孔蛋白　； 参考：《江苏大学》2008年硕士论文

【摘要】： 目的:克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)微孔蛋白(porin)HopX编码基因;原核表达并纯化HopX融合蛋白;制备针对HopX融合蛋白的兔源性多抗;通过体外实验观察微孔蛋白HopX诱导人胃癌细胞株SGC7901表达分泌IL-8的能力,并初步探讨MAPK信号通路在HopX诱导SGC7901细胞表达分泌IL-8中的作用;探讨HopX对人胃癌细胞株SGC7901增殖能力的影响。为进一步了解幽门螺杆菌微孔蛋白HopX的生物学功能奠定基础。 方法: 1)应用PCR技术从Hp DNA基因组扩增微孔蛋白HopX编码基因片段,将其TA克隆和测序,并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较,用信息学软件分析其物理化学特性; 2)以重组质粒pQE30-hopX转化E.coli M15宿主菌,IPTG诱导阳性E.coli M15菌株,用NTA-Ni~(2+)树脂分离纯化所表达的HopX融合蛋白,纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定; 3)将融合蛋白HopX与弗氏佐剂充分乳化后,免疫家兔,制备抗HopX抗血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)测其效价; 4)不同浓度蛋白HopX与SGC7901细胞共培养不同时间,设阳性对照和阴性对照;收集培养上清,ELISA法检测分泌IL-8蛋白的量;提取细胞总RNA后,荧光定量RT-PCR检测IL-8mRNA表达水平;用MAPK信号通路ERK1/ERK2特异性抑制剂PD-98059预先处理细胞,再加入HopX与细胞作用,提取细胞总RNA,荧光定量RT-PCR检测IL-8mRNA表达水平的变化; 5)应用细胞计数、细胞活力、MTT方法观察HopX对细胞增殖的影响;通过细胞周期和DNA倍体分析、DNA凝胶电泳,Hoechest33258荧光染色等方法分析HopX诱导SGC7901细胞凋亡作用。 结果: 1)扩增hopX基因全长为1284bp,(申请GenBank的登录号为EF208122)与GenBank公布的ATCC43504及J99同源性为97%,与26695同源性为96%。软件预测表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为47kDa,并显示具有良好的抗原性。 2)成功构建pQE30-hopX原核表达重组质粒。通过NTA-Ni~(2+)树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的HopX融合蛋白,SDS-PAGE及Western Blot鉴定大小约为47KDa,与预测一致。 3)HopX融合蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,效价为1:8×10~4。 4)HopX可诱导胃癌细胞SGC7901表达和分泌IL-8,该效应呈浓度依赖性;经PD-98059处理后,细胞IL-8mRNA表达水平与未处理前相比明显下降。 5)HopX可抑制SGC7901细胞的增殖及活力,呈剂量-时间依赖关系。未出现典型的凋亡形态改变。 结论:本研究首次克隆NCTC11637 hopX基因,成功构建pQE30-hopX载体并获得原核表达的HopX融合蛋白;HopX可诱导胃癌细胞株SGC7901表达和分泌IL-8,该作用在一定程度上依赖MAPK信号通路;纯化的HopX蛋白对胃癌细胞SCG7901的增殖和细胞活力都有一定的抑制作用。以上的研究为更进一步探讨Hp外膜蛋白生物学功能、致病机制及Hp疫苗的研究奠定了基础。
[Abstract]:Objective: to clone Helicobacter pylori (Helicobacter pylori) porin HopX gene, prokaryotic express and purify HopX fusion protein, and prepare rabbit polyclonal antibody against HopX fusion protein. To observe the ability of human gastric cancer cell line SGC7901 to express and secrete IL-8 induced by HopX in vitro, and to explore the role of MAPK signal pathway in the expression and secretion of IL-8 in SGC7901 cells induced by HopX, and to explore the effect of HopX on the proliferation of human gastric cancer cell line SGC7901. It lays a foundation for further understanding the biological function of Helicobacter pylori microporin HopX. Methods: 1) the micropore protein HopX coding gene fragment was amplified by PCR from the HP DNA genome, cloned and sequenced, and compared with the gene sequence of other HP strains published by GenBank. The physical and chemical properties of the recombinant plasmid pQE30-hopX were analyzed by the software of informatics. 2) the recombinant plasmid pQE30-hopX was transformed into E. coli M15 to induce the positive E. coli M15 strain by IPTG, and the expressed HopX fusion protein was isolated and purified by NTA-NiAX) resin. The purified protein was identified by SDS-PAGE electrophoresis and Western Blot. 3) the fusion protein HopX was emulsified with Freund's adjuvant and then the rabbit was immunized to prepare anti-HopX antiserum. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) was used to determine its titer. 4) different concentrations of protein HopX and SGC7901 cells were co-cultured for different time, positive control and negative control were set up, and the amount of IL-8 secreted by Elisa in culture supernatant was detected by Elisa. After total RNA was extracted, IL-8 mRNA expression was detected by fluorescence quantitative RT-PCR, and PD-98059, a specific inhibitor of ERK1 / ERK2, was pre-treated with MAPK signaling pathway, and then HopX was added to the cells. Total RNAs were extracted and the expression of IL-8 mRNA was detected by fluorescence quantitative RT-PCR. 5) the effect of HopX on cell proliferation was observed by cell count and MTT assay. Cell cycle and DNA ploidy analysis were used to analyze the apoptosis of SGC7901 cells induced by HopX by Hoechest33258 fluorescence staining. Results: 1) the total length of hopX gene was 1284 BP (accession number of GenBank was EF208122) and the homology of ATCC 43504 and J99 published by GenBank was 97 and 96 with 26695 respectively. The software predicted the relative molecular weight of the expressed protein was about 47 kDa and showed good antigenicity. 2) the prokaryotic expression plasmid pQE30-hopX was successfully constructed. The target protein was isolated and purified by NTA-NiHX (2) resin. The expressed HopX fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western Blot to be about 47 KDa. it was consistent with the prediction that the fusion protein was used to immunize rabbits to obtain polyclonal antibodies. The titer was 1:8 脳 104.4HopX could induce the expression and secretion of IL-8 in SGC7901 cells in a concentration-dependent manner, and was treated with PD-98059. The expression of IL-8 mRNA in SGC7901 cells was significantly lower than that before treatment. 5. HopX inhibited the proliferation and activity of SGC7901 cells in a dose-time dependent manner. No typical morphological changes of apoptosis were observed. Conclusion: in this study, NCTC11637 hopX gene was cloned for the first time, and pQE30-hopX vector was successfully constructed, and the prokaryotic expression of HopX fusion protein HopX could induce the expression and secretion of IL-8 in gastric cancer cell line SGC7901, which depends on MAPK signaling pathway to some extent. The purified HopX protein inhibited the proliferation and viability of gastric cancer cell line SCG7901. The above studies have laid a foundation for further study on the biological function, pathogenesis and HP vaccine of HP outer membrane protein.
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R378.3

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本文编号：2048681