鼠疫耶尔森氏菌蛋白对宿主NF-κB通路的影响及YpkA激酶活性的研究

发布时间：2018-06-25 03:27

  本文选题：鼠疫菌 + T3SS　； 参考：《南华大学》2013年硕士论文

【摘要】：目的： 1.病原菌的入侵通常引起宿主NF-κB信号通路的活化，，鼠疫菌蛋白SycE、YscL、YscS是T3SS的组成成分，YscL是为T3SS转运效应蛋白提供能量的YscNATTPase的调控蛋白；YscS是分泌装置的成分蛋白。通过检测鼠疫菌蛋白SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL对宿主NF-κB信号通路的影响，对初步研究鼠疫菌可能的致病机制提供依据。 2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白，VASP是人的一种细胞骨架调节蛋白，通过体外验证YpkA对VASP的磷酸化作用，对鼠疫菌的致病可能的机制进行初步的探讨。 方法： 1. LB液体培养基常规培养鼠疫耶尔森氏菌，试剂盒提取其基因组DNA。设计引物，PCR扩增yscL基因，插入pCMV-Myc质粒，构建重组质粒pCMV-Myc-yscL，经测序分析正确后大量提取质粒，去内毒素后用于转染293T细胞。 2.大量提取本实验室已构建好的表达SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去内毒素提取质粒，转染293T细胞。 3.利用瞬时转染技术，将以上提取的质粒分别转入293T细胞，以anti-Myc抗体为一抗，WB方法检测以上5种蛋白在293T细胞中的表达。表达正确后，再分别与表达萤火虫荧光素酶的pBII-LUC质粒和表达海肾荧光素酶的pRL-TK质粒共转染293T细胞。然后用TNF-α刺激293T细胞，在化学发光板上检测荧光素酶的活性。 4.在大肠杆菌BL21中表达YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B珠子纯化YpkA；在293T细胞中表达VASP，Flag珠子纯化VASP。将纯化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶缓冲液混合，30℃反应30min，设立阳性和阴性对照组，分别用WB和同位素标记法检测VASP的磷酸化。 5.统计软件SPSS13.0分析实验结果，统计方法为方差分析。 结果： 1.序列分析结果显示pCMV-Myc-yscL构建正确。 2. WB结果显示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T细胞中得到正确表达。 3.双荧光素酶报告基因实验结果显示：SycE、YPO3877、YscS和YscL实验组的荧光素酶活性比阴性对照组降低，差异有统计学意义（P 0.05）；YPO2940组荧光素酶活性比阴性对照组没有降低，差异无统计学意义（P0.05）。 4. WB结果没有检测到YpkA对VASP的磷酸化作用，而同位素标记法检测到了YpkA对VASP的磷酸化。 结论： 1.鼠疫菌蛋白SycE、YPO3877、YscS和YscL具有抑制NF-κB信号通路活化的作用，而鼠疫菌蛋白YPO2940没有抑制293T细胞NF-κB信号通路活化的作用。 2.体外YpkA能够将VASP磷酸化。
[Abstract]:Objective: 1. The invasion of pathogenic bacteria usually causes the activation of NF- 魏 B signaling pathway. YSCL is the constituent of T3SS, YscL is the regulating protein of YscNATase which provides energy for T3SS transport effector protein, YscS is the component protein of secretory device. The effects of YPO3877 (YSCS) and YscL (YSCL) on the NF- 魏 B signaling pathway of the host were detected by the YP2940 protein of Yersinia pestis. 2. YpkA is a kind of cytoskeleton regulatory protein of Yersinia pestis type 鈪

本文编号：2064339