PGE2调节前列腺中芳香化酶和钙结合蛋白S100A8分子机制的研究

发布时间：2018-07-05 06:58

  本文选题：前列腺素 + E2(PGE2)　； 参考：《南开大学》2010年博士论文

【摘要】：目的前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)是一种重要的炎性因子。它通过调节细胞增殖、迁移和凋亡等生物学行为在许多疾病中发挥重要作用。在良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)和前列腺癌(prostate cancer, PCa)组织中PGE2的浓度明显增加,但对其作用分子机制的研究鲜有报道。BPH间质细胞中芳香化酶和PCa上皮细胞中钙结合蛋白S100A8的表达明显增加。本文研究PGE2调节芳香化酶和S100A8的信号通路,为阐明PGE2在BPH和PCa中可能的作用机制提供理论和实验依据。 第一部分PGE2在ERRα的介导下促进前列腺间质细胞中芳香化酶的表达 方法用RT-PCR法检测人前列腺间质细胞系WPMY-1中PGE2受体EPs的表达；在WPMY-1中,分别添加PGE2和／或PGE2受体EP2拮抗剂AH6809和激动剂butaprost、蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制剂H89、MEK激酶抑制剂PD98059和cAMP激活剂forskolin,用Real-time RT-PCR和Western blot法检测雌激素受体相关受体(Estrogen receptor-related receptorα, ERRa)的基因和蛋白水平的表达；用cAMP试剂盒检测PGE2对间质细胞中cAMP浓度的影响；添加PGE2和/或ERRα拮抗剂氯丹、转染ERRα的siRNA或表达质粒,用Real-time RT-PCR、Western blot和双荧光素酶活性实验方法检测ERRα在PGE2调节WPMY-1细胞中芳香化酶的表达及其影响启动子活性中的介导作用；用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunopreciptation Assay, ChIP)方法检测PGE2对ERRα结合芳香化酶启动子的影响；用酶联免疫方法检测添加PGE2联合转染ERRαsiRNA或表达质粒的间质细胞培养液中雌二醇的浓度。 结果WPMY-1细胞表达除EP1外的其余三种EP受体；PGE2或EP2的激动齐butaprost或cAMP激活剂forskolin能够促进ERRαmRNA和蛋白的表达；EP2的拮抗剂AH6809和PKA抑制剂H89能够完全拮抗PGE2对ERRα表达的上调作用,而MEK激酶抑制剂PD98059则无明显作用；PGE2能够以时间依赖方式促进cAMP的生成；用ERRα拮抗剂氯丹或siRNA以及用ERRα的表达质粒能够明显阻断或促进PGE2对芳香化酶基因表达和启动子活性的上调作用；在细胞内ERRα通过直接特异性结合芳香化酶启动子pI.3/Ⅱ激活转录,而且PGE2可以加强这种促进转录作用；PGE2联合转染ERRαsiRNA或表达质粒的间质细胞培养液中雌二醇的浓度与PGE2和ERRα的水平呈正相关。 结论在前列腺间质细胞中,PGE2在EP2介导下通过PKA信号通路促进ERRα的表达；ERRα作为转录因子介导了PGE2对芳香化酶表达的促进作用,进而导致间质细胞中雌二醇浓度的增加。提示,PGE2可能在促进前列腺中雌激素的生成以及由于雌激素效应的增加诱导前列腺间质增生中发挥重要的作用。 第二部分PGE2在C/EBPβ的介导下促进前列腺癌上皮细胞中S100A8的表达 方法在人前列腺癌上皮细胞系PC-3中,添加PGE2和／或PGE2受体EP2拮抗剂AH6809、EP4拮抗剂AH23848、PKA抑制剂H89和cAMP激活剂forskolin,用Real-time RT-PCR和双荧光素酶活性实验方法检测S100A8的表达和启动子活性；用cAMP试剂盒检测PGE2对PC-3细胞中cAMP浓度的影响。用Real-time RT-PCR和Western blot法检测PGE2对C/EBPβ的基因和蛋白表达的影响；用Western blot法检测PGE2对C/EBPβ磷酸化的影响；添加PGE2和／或转染增强子结合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding proteinβ, C/EBPβ)的siRNA或表达质粒,用Real-time RT-PCR和双荧光素酶活性实验方法检测C/EBPβ在PGE2调节PC-3细胞中S100A8表达及其影响启动子活性中的介导作用。用免疫组化染色法检测前列腺癌组织的连续切片中环氧合酶2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)和S100A8的表达及定位情况。 结果PGE2能够以时间和浓度依赖的方式促进PC-3细胞中S100A8基因的表达和cAMP的生成；EP2的拮抗剂AH6809、EP4的拮抗剂AH23848和PKA抑制剂H89能够拮抗PGE2对S100A8表达和启动子活性的上调作用；cAMP激活剂forskolin亦可以促进S100A8的表达和启动子的活性。PGE2能够以时间依赖的方式促进C/EBPβ基因和蛋白的表达及其磷酸化水平；C/EBPβ的siRNA能够明显阻断PGE2对S100A8基因表达和启动子活性的上调作用；C/EBPβ的表达质粒能够明显促进S100A8的表达和启动子的活性。在同一前列腺组织切片中,COX-2和S100A8在正常腺体部分的上皮细胞呈阴性染色,而癌腺体上皮细胞呈明显阳性染色。 结论在前列腺癌上皮细胞中,PGE2在EP2和EP4受体的介导下通过PKA信号通路促进S100A8的表达；PGE2亦能够促进C/EBPβ的表达和转录活性；C/EBPβ作为转录因子介导了PGE2对S100A8表达的促进作用。提示,PGE2可能通过上调钙结合蛋白S100A8在前列腺癌中发挥重要的作用。
[Abstract]:Objective To study the role of PGE2 in benign prostatic hyperplasia ( BPH ) and prostate cancer ( PCa ) .


The first part PGE2 promotes the expression of aromatic enzymes in prostate stromal cells mediated by ERR 伪


Methods The expression of PGE2 receptor EPs in human prostatic stromal cell line WPMY - 1 was detected by RT - PCR .
In WPMY - 1 , we add PGE2 and / or PGE2 receptor EP2 antagonist , AH6809 and agonist , H89 , MEK kinase inhibitor PD98059 and cAMP activator forskolin respectively , and detect the gene and protein level of estrogen receptor - related receptor 伪 ( ERRa ) by Real - time RT - PCR and Western blot .
The effect of PGE2 on cAMP concentration in interstitial cells was determined by cAMP kit .
Addition of PGE2 and / or ERR 伪 antagonist chlordane , transfection of ER伪 siRNA or expression plasmid , real - time RT - PCR , Western blot and dual luciferase activity assay were used to detect the expression of the aromatic enzyme in the WPMY - 1 cell and its effect on promoter activity .
The effect of PGE2 on the promoter of ER伪 - binding aromatic enzyme was determined by the method of chromatin immunoptation assay ( ChIP ) .
The concentration of estradiol in the interstitial cell culture solution supplemented with PGE2 co - transfected with the ERR - siRNA or the expression plasmid was detected by an enzyme - linked immunosorbent assay .


Results WPMY - 1 cells expressed the remaining three EP receptors except EP1 ;
The agonist of PGE2 or EP2 or cAMP activator forskolin can promote the expression of ER伪 mRNA and protein .
The antagonist of EP2 , AH6809 and H89 , can inhibit the up - regulation of PGE2 on the expression of ER伪 , while MEK kinase inhibitor PD98059 has no obvious effect .
PGE2 can promote the production of cAMP in a time - dependent manner ;
using the ERR alpha antagonist chlordane or siRNA and the expression plasmid with ERR . alpha . can obviously block or promote the up - regulation effect of PGE2 on the expression of the aromatic enzyme gene and the promoter activity ;
in that intracellular ERR . alpha . , transcription is activate by direct specific binding of the p.3 / 鈪，

本文编号：2099385