BC022687基因原核及真核重组质粒的构建及表达
本文关键词：BC022687基因原核及真核重组质粒的构建及表达，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的：构建BC022687（N端）的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达融合蛋白；构建BC022687（全长）基因真核表达载体，探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。 方法：1.以健康成年雄性小鼠的睾丸组织为来源，进行RT-PCR，建立小鼠睾丸cDNA文库；2.以小鼠睾丸cDNA文库为模板，PCR扩增BC022687（N端）编码序列及全长编码序列；3. TA克隆后测序；4.构建BC022687（N）端原核质粒，以pET-28a（+）原核质粒为载体，并转化大肠杆菌BL-21细胞，诱导蛋白表达，用Western Blot鉴定融合蛋白，Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白；5.构建BC022687（全长）真核质粒，以pEGFP-C1真核质粒为载体，，并转染CHO细胞，诱导蛋白表达，Western blot及激光共聚焦验证细胞内BC022687（全长）融合蛋白的表达与定位。 结果：1. BC022687（N端）/pET-28a（+）原核质粒构建成功，获得纯化的BC022687-His融合蛋白并在大肠杆菌内高效表达；2.构建BC022687（全长）/pEGFP-C1真核质粒构建成功，重组融合蛋白BC022687/GFP在转染细胞内表达并定位于胞质及中心体。结论：1.成功构建BC022687原核及真核及表达质粒并获验证其表达，为进一步研究该蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。
【关键词】：男性不育 BC022687 质粒构建 蛋白纯化
【学位授予单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：
- 表1 英汉缩略词表4-5
- 摘要5-6
- Abstract6-9
- 第一章 前言9-11
- 第二章 材料和方法11-27
- 1 主要实验材料仪器及试剂配制11-14
- 1.1 主要试剂11
- 1.2 实验动物11
- 1.3 载体和菌株11
- 1.4 主要实验仪器11-12
- 1.5 主要溶液试剂的配制12-14
- 2 方法14-27
- 2.1 BC022687(N 端)原核质粒的构建，表达及蛋白纯化14-21
- 2.1.1 睾丸组织总 RNA 的提取及 RT-PCR14-15
- 2.1.2 BC022687 基因 N 端编码序列的扩增15-16
- 2.1.3 琼脂糖凝胶电泳16-17
- 2.1.4 PCR 产物纯化17
- 2.1.5 TA 克隆17
- 2.1.6 TA 克隆连接产物的转化与筛选17-18
- 2.1.7 质粒的提取与纯化18
- 2.1.8 重组质粒进行进行鉴定18
- 2.1.9 原核重组质粒 BC022687(N 端)/pET-28a（+）的构建18-19
- 2.1.10 BC022687(N 端)/pET-28a（+）重组质粒的鉴定19-20
- 2.1.11 重组质粒诱导表达后 Western blot 进一步验证20-21
- 2.1.12 6×His Tag 蛋白亲和纯化21
- 2.2 BC022687(全长)真核质粒的构建，转染表达及定位21-27
- 2.2.1 BC022687 真核质粒的构建21-25
- 2.2.2 BC022687(全长)/pEGFP-C1 重组质粒转染哺乳细胞25-27
- 第三章 结果27-39
- 1 提总 RNA 的结果27
- 2 BC022687（N 端）原核重组质粒的构建，表达及蛋白纯化结果27-33
- 2.1 BC022687（N 端）片段 PCR 结果27-28
- 2.2 BC022687（N 端）/pCR 2.1TA vector 重组质粒双酶切鉴定结果28-29
- 2.3 BC022687（N 端）/pCR 2.1TA vector 克隆重组质粒测序结果29
- 2.4 BC022687（N 端）/pET-28a（+）原核质粒的双酶切鉴定29-30
- 2.5 BC022687（N 端）/pET-28a（+）原核质粒的测序报告30
- 2.6 蛋白含量测定结果30-31
- 2.7 SDS-PAGE 分析31-32
- 2.8 BC022687（N 端）/pET-28a（+）重组质粒表达的融合蛋白 Western blot 分析结果32
- 2.9 原核融合蛋白的纯化结果32-33
- 3. BC022687(全长)真核质粒的构建，表达及蛋白定位结果33-39
- 3.1 BC022687(全长)PCR 结果33-34
- 3.2 BC022687（全长）/pCR 2.1TA vector 重组质粒的双酶切鉴定结果34
- 3.3 BC022687 (全长)/pCR 2.1 TA vector 重组质粒的测序结果34-35
- 3.4 BC022687 (全长)/pEFGP-C1 重组质粒的双酶切鉴定结果35
- 3.5 BC022687（全长）/pEFGP-C1 重组质粒的测序结果35-36
- 3.6 BC022687（全长）/pEFGP-C1 重组质粒转染 CHO 细胞后的 Western Blot 结果36-37
- 3.7 BC022687(全长)/GFP 融合蛋白在细胞内的定位37-39
- 第四章 讨论39-40
- 第五章 本次研究的不足40-41
- 参考文献41-44
- 综述44-48
- 参考文献47-48
- 硕士期间科研工作48-49
- 致谢49
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 段红英;丁笑生;卢龙斗;;WD-repeat蛋白及其在植物中的作用[J];安徽农业科学;2007年04期
2 叶雪,牛昀,方志沂;中心体异常、基因不稳定性与肿瘤[J];癌症;2005年10期
3 邢文晓;杨燕;杨梅花;;男性精液检测结果与不育原因分析[J];河北医药;2012年04期
4 文甲明;蒋先镇;汤育新;阳建福;陈厚仰;刘志中;;人睾丸特异表达基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定[J];中南大学学报(医学版);2010年03期
5 周安方,张长城;精索静脉曲张性不育的病机与治则探讨[J];湖北中医学院学报;2004年01期
6 潘俊敏;;衣藻、纤毛与“纤毛相关疾病”[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年05期
7 张方;施毅;辛晓峰;刘玉秀;宋勇;钱桂生;罗向东;赵明;李子玲;;大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选[J];解放军医学杂志;2006年05期
8 左阳花;冯播;薛惠英;范雪芹;;淮安地区4598例不育男性精液质量分析[J];检验医学与临床;2012年02期
9 宋博;蔡志明;;精子形成的调控机制及其进展[J];现代泌尿外科杂志;2011年06期
10 李涛;张伟;郭柏鸿;李国平;罗能钦;郭庆华;王伟;李朝彬;陈一戎;;肿瘤坏死因子α-308多态性与弱精子症关系的研究[J];中华男科学杂志;2010年11期
本文关键词：BC022687基因原核及真核重组质粒的构建及表达，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：285089
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shiyanyixue/285089.html
