系统性红斑狼疮抗核抗体易感基因染色体定位研究

发布时间：2020-11-10 14:53

　　 实验目的 系统性红斑狼疮(SLE)是典型多基因遗传的自身免疫性疾病，发病率较高，多发于年轻女性，其重要特征是T和B淋巴细胞对自身核抗原耐受性丧失，产生多种抗核抗原成分抗体，形成免疫复合物沉积于不同组织并引起炎症。遗传、环境、免疫、激素等多种因素参与自身抗体产生及SLE发病，其中遗传因素起重要作用。 随着单基因病遗传连锁分析的巨大成功，以及人类基因组计划实施以后对基因分析方法的推动，复杂疾病致病基因的克隆成为当代遗传学研究的重点。通过特征表型进行疾病易感基因染色体定位，对揭示疾病成因有重要意义。自身抗体是自身免疫病的重要标志，抗核抗体为引起狼疮细胞形成的主要抗体，也是SLE最早被检测的自身抗体之一，一般在确诊SLE两年前患者血清中已出现抗dsDNA抗体，抗染色质抗体则出现更早。SLE患者和狼疮鼠模型自身免疫反应的发作都以自身抗核抗体的早期出现为特征，因此抗核抗体的产生对SLE发病起着决定性的作用。狼疮鼠可自发出现抗核抗体，在无菌环境亦然，提示外来因素对自身抗核抗体的影响不大；SLE病人的健康一级亲属也有自身抗核抗体的出现，同卵双生子血清抗体一致率高达92％，说明先天遗传因素是其发生的主要原因。 以人为对象进行遗传连锁分析研究，难度较大，重复性差。狼疮鼠在遗传定位研究方面有不可比拟的优势。应用微卫星遗传标记结合数量性状位点分析，可以对复杂疾病进行精确的易感基因染色体定位。本课题以(NZB×NZW)F1×NZB和(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠为研究对象，对来源于NZW和NZB小鼠的系统性红斑狼疮自身抗核抗体易感基因进行微卫星DNA遗传标记QTL分析，确定小鼠的IgG型抗染色质自身抗体、抗DNA自身抗体和抗组蛋白自身抗体的易感基因的染色体精确定位，为人类同源基 因的克隆和鉴定奠定基础，并为进一步阐明SLE及其它自身免疫病的发病 机理，以及开发新的可靠的治疗方法提供理论依据。 实验方法 1，以酶联免疫吸附分析法检测8月龄新西兰狠疮鼠NZB、NZW、NZB/ WFI血清中IgG、I娜型抗DNA抗体和抗染色质、组蛋白抗体滴度，比较 NZB、NZW、NZB/W FI各种抗体水平。 2.繁育回交小鼠，筛选NZB和NzW间具有长度多态性的微卫星DNA 遗传标记，染色体两端遗传标记距两端距离10 cM(里摩)，遗传标记之间 距离20。M，最终选出覆盖除性染色体外的全部19条染色体的共约200 个多态性微卫星DNA遗传标记。 3.基因分型:提取鼠尾DNA，用覆盖小鼠全部基因组的近200个微卫 星DNA遗传标记进行PCR一SSLP(PCR一Single Se卿enee玩n纳Polymor- phism)分析，根据分离片段大小确定每只小鼠的每个微卫星DNA遗传标记 位点的基因型。 4.回交小鼠血清抗体水平分析:以酶联免疫吸附分析法(EUSA)测定8 月龄回交小鼠IgG、IgM型抗染色质抗体、抗DNA抗体、抗组蛋白抗体值。 5 .QTL分析:将每只小鼠的每个微卫星DNA遗传标记位点的基因型和 抗体值输人MAPMAKE形QTL和MAPMANAGE甲QTL分析软件数据库中， 进行基因组扫描，确定狼疮鼠抗染色质抗体、抗DNA抗体、抗组蛋白抗体易 感基因的染色体定位。增加基因组扫描峰值附近的微卫星DNA遗传标记 数量，以获取更精确的易感基因染色体定位。 6.根据QTL分析结果，利用互联网查阅基因组数据库，筛选候选基因， 为进一步定性和克隆这些基因打好基础。 实验结果 一、sLE模型新西兰小鼠I步、坛M型抗核抗体水平分析 1.8月龄NzB小鼠I醛型抗dsDNA抗体及I娇型抗ssDNA抗体平均 滴度较低。NZW鼠比NZB略高，但无明显差异。与亲代NzB及NzW相 比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I多型抗dsDNA抗体及抗ssDNA抗体滴度 明显升高，与亲代差异非常显著(P0.001)。 2.8月龄NZB小鼠IgM型抗dsDNA抗体及IgM型抗ssDNA抗体平均 滴度较高，与NZW差异显著(P0 .01)。(NZB x NzW)Fl子代I娜型抗 山DNA及抗ssDNA抗体滴度比NZW增高且差异显著(P0.01)，比NZB 则降低。 3·8月龄NzB、NZW小鼠I步型抗染色质抗体及I步型抗组蛋白抗体 平均滴度较低。与亲代NZB及NZW相比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I步 型抗染色质及组蛋白抗体滴度明显增高，与亲代差异非常显著(P0 .05)。 4·8月龄NZB小鼠IgM型抗染色质抗体及IgM型抗组蛋白抗体平均滴 度较高，与NzW差异显著(P0.05)。(NZB x NZW)FI子代IgM型抗染色 质及抗组蛋白抗体滴度比NZW增高且差异显著(P0 .05)，比NZB则降 低。 二、SLE模型新西兰小鼠抗DNA抗体易感基因染色体定位的研究 1.QTL分析确定(NZB xNZW)Fl xNZW回交鼠I步型自身抗dsDNA、 ssDNA抗体遗传易感基因的定位:I药型自身抗dsDNA抗体及ssDNA抗体 的易感基因位于小鼠第17染色体近中心端，与微卫星DNA遗传标记 D17MIT61、D17MIT22、TNFa、D17Mrr168有较强连锁，玩ds值均5。这是 小鼠H一2复合体包括TNFa的基因区域。 候选的易感基因位点来源的确定:通过比较回交小鼠在易感基因 D17MI竹2 B/W、W/W型之间的血清自身抗dsDNA抗体水平的平均值，经t 一检验结果显示，B/W型W/W型，P值0.001，说明易感基因来源于 NzB;比较翎FaB/W、W/W型之间的血清自身抗dsDNA抗体水平的平均 值，
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R392
【部分图文】：

以t检验进行组间差异比较。实验结果1.新西兰小鼠抗DNA抗体滴度比较(见表l一l，图1一2)8月龄NzB小鼠I笋型抗一dsDNA抗体及IgG型抗一ssDNA抗体平均滴度较低。NZW鼠比NZB略高，但无明显差异。与亲代NZB及NZW相比，(NZBxNZW)Fl子代小鼠I娇型抗dsDNA抗体及抗ssDNA抗体滴度明显增高，与亲代差异非常显著(P<0.001)。8月龄NzB小鼠I少型抗一dSDNA抗体及IgM型抗一ssDNA抗体平均滴度较高，与NzW差异显著(p<0.01)。(NZBxNZW)FI子代IgM型抗dsDNA及抗ssDNA抗体滴度比NZW增高且差异显著，比NZB则降低。

图1一3)8月龄NzB、Nzw小鼠I笋型抗染色质抗体及IgG型抗组蛋白抗体平均滴度较低。与亲代NZB及NZW相比，(NZBxNzW)FI子代小鼠IgG型抗染色质及组蛋白抗体滴度明显增高，与亲代差异非常显著(P<0.05)。8月龄NzB小鼠IgM型抗染色质抗体及IgM型抗组蛋白抗体平均滴度较高，与NZW差异显著(P<0.05)。(NZBxNZW)FI子代IgM型抗染色质及抗组蛋白抗体滴度比NZW增高且差异显著，比NZB则降低。表1一2NZB，NzW，NZB/WFI小鼠血清I笋、IgM型抗染色质、组蛋白抗体滴度比较(又士SE)Tabl一2ComparisonofthetiterofIgGandIgManti一ehromatinandanti一histoneantibodiesinNZB，NZW

2.5基因分型:根据PCR产物即扩增的微卫星DNA分离片段大小决定回交小鼠基因型。图2一2显示(NZBxNZW)FIxNZW回交小鼠的电泳分型，如在PAGE胶上是较亮的二条片段，则为W/W型，三条片段为B/W型。图2一2(NZBxNZW)xNZW回交小鼠的基因分型Fig.2一2Genot即ingof(NzBxNZw)xNZwbaekcross而ce
【参考文献】

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1 蔡善荣,刘希永,郑树,李鲁;人类基因组STR及其应用[J];国外医学.遗传学分册;2000年02期

2 弓娟琴,陈志强,胡兹嘉,李文忠;系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中IL-4和IL-13mRNA的表达[J];中国免疫学杂志;2001年09期

本文编号：2878060