TGFβ1基因转染大鼠树突状细胞增强移植心脏耐受性及相关趋化因子表达的研究

发布时间：2020-11-14 20:35

　　 目的： 1．建立从大鼠骨髓前体细胞分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell, DC)的方法；研究影响骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)分化、成熟的相关因素以及不同分化时期DC的免疫免疫生物特性。 2．构建人TGFβ1基因的真核表达质粒TGFβ1-pcDNA3以及反义TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并转染大鼠DC，研究TGFβ1基因转染对DC的成熟分化以及免疫功能的影响。 3．观察TGFβ1-DC在受者大鼠体内迁移归巢途径及微嵌合水平，检测受者次级淋巴器官T细胞凋亡和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的变化。 4．探讨TGFβ1-DC对移植心脏的急性排斥反应发生时间、排斥反应级别以及存活时间的影响；并进一步研究TGFβ1-DC输注对移植受者体内多种相关趋化因子及其受体表达的影响。 方法： 分离F344大鼠骨髓前体细胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。分别从形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学(FACS，ICC)以及免疫生物学(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。构建重组人TGFβ1-pcDNA3表达质粒，并转染DC制备TGFβ1-DC，应用多种分子生物学技术(RT-PCR, Western blot等)及免疫学技术研究TGFβ1基因转染对于DC发育分化、分子表型以及免疫功能的影响，检测TGFβ1-DC刺激T细胞增殖的能力；TGFβ1-DC异体输注Lewis大鼠后，以免疫组织化学检测TGFβ1-DC的迁移路线和分布特征，TUNEL检测受者脾T细胞凋亡以及端粒酶逆转录酶hTERT的表达。按Ono's方法建立大鼠同种异体心脏移植模型，观察TGFβ1-DC输注对于移植心脏排斥反应出现时间、反应级别以及存活时间的影响，以免疫组织化学方法观察移植后相关趋化因子的表达和变化。 结果： 中文摘要 1、应用细胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前体细胞在培养第6天时，可观 察到有大小不等的集落生成，吞饮和吞噬能力较强，MLR实验中不能刺 激T细胞增殖。培养至第ro天，集落减小并减少，多数细胞从集落中 释放，散在悬浮细胞增多。细胞多具有较长的树枝状突起，细胞吞饮吞 噬能力减低，MHCll类分子和B7一2分子表达增高，刺激T细胞能力增 强。应用n庄L一4可提高细胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前体细胞经过扩 增可得到8一20xl护个细胞。 2、一定浓度的thTGF印对Dc的扩增和分化具有抑制作用，细胞集落较少， 细胞成熟缓慢，大多数细胞无突起或突起较短。MHCll类分子和B7一2 分子表达较低，刺激T细胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指数与IL一4对照组细胞无明显差异，细胞得率略低。 3、通过酶切后连接、质粒转化、扩增与抽提，构建得到TGFpl重组真核表 达质粒TGF印一peDNA3。经酶切电泳和DNA测序鉴定，证实重组质粒 构建正确。 4、以Westem blot、RT-PCR、免疫细胞化学以及免疫荧光染色显示脂质体 DOTAp可介导TGF困一peDNA3转染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表达，经测定转染效率可达到18~23%。 5、应用FAcs和免疫细胞化学等方法检测发现，转染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表达均明显低于 对照组，MLR显示，TGF印一DC刺激T细胞增殖能力低下。TGF印基 因转染对DC生长无明显抑制作用。 6、转染后各组DC输注Lewis大鼠发现，各组DC主要归巢到受者大鼠的 次级淋巴器官胸腺依赖区，其中尤其以TGF印一DC组在输注后第7一14 天时在脾的动脉周围淋巴鞘和边缘区数量最多。 7、经TUN旧L、hTERT等方法显示，TGFpl一DC组受者大鼠脾动脉周围淋 巴鞘等处的T细胞凋亡水平明显高于对照组，并且发现该组的T细胞 h花RT表达水平明显低于对照组。 8、各组DC异体输注一周后行F344叶Lewis大鼠的心脏移植，发现 TGF印一DC组排斥反应发生时间延迟，排斥反应级别明显降低，移植心 中文摘要 脏存活时间显著延长，最长可达51天，平均存活时间达到33.14士7.88 天，与其它组相比具有显著差异(p0 .01) 9、研究各组移植心脏、受者脾和淋巴结等器官趋化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受体的表达，发现TGF印一DC输注不同程度地降低 了以上趋化因子的表达，改变其表达模式，提示TGF印下调相关趋化因 子表达可能是TGF印一DC增强移植心脏耐受性的机制之一。 结论: 1、TGF印可降低培养BM一Dc的MHcll类分子和B7一2分子表达以及刺激 T细胞能力，该效应可被LPS所逆转。 2、脂质体介导TGF印基因转染Dc可以获得有效表达，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均显示TGF印一DC为imDC。 3、TGF印一Dc术前输注受者大鼠可延迟移植心脏排斥反应发生时间，降低 排斥反应级别，延长移植心脏存活时间。 4、TGF印一DC输注可改变移植心脏及受者次级淋巴器官相关趋化因子及 其受体的表达程度和表达模式。 创新点及意义: 1、结合以往小鼠DC培养经验，经过改良，建?
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392
【部分图文】：

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不一的细胞集落(loox)图l一IB.培养sd，筛选后的DC集落(loox)图1一IC.培养6d，扩增的DC集落(2oox图l一ID.培养gd，DC由集落释放，悬浮生长于培液中(2oox)含A图l一ZA培养6dA组DC，Giemsa染色示细胞突起少，胞质中有较多囊泡(400x)图l一ZB.培养10dA组DC，Giemsa染色示细胞突起多而长，囊泡减少(4oox)‘户备‘.每C图l一ZC.培养10dB组DC

呈帆状(3(X)ox)图1一3C.扫描电镜示培养12dA组DC突起丰富，呈树枝状(4(XX)x)图1一4A.培养10dA组DC透射电镜像，显示胞质内少量囊泡和大量糖原，突起多而长(40(刃x)吟‘J.I口J一一一月B图1一4B.培养10dB组DC透射电镜像，胞质内较多囊泡，突起较少(4《XX)x)图l一SA.DII荧光染色示培养10d的A组DC(4(X)x)，令二‘.件J今1..、、称刁，，、-.犷，户‘，份
【参考文献】

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本文编号：2883925