HBV转录后调节序列在非细胞毒机制中的作用及其异质性的生物学意义

发布时间：2020-11-15 01:52

　　 对乙型肝炎病毒转录后调节序列(HPRE)在非细胞毒机制中的作用及其异质性的生物学意义进行研究，探讨IFN-γ、TNF-α和IFN-α对乙型肝炎病毒转录后调节的影响。 体外构建含有HPRE片段的pDM138质粒(含有CAT报告基因)，应用脂质体介导方法转染HepG_2细胞，观察细胞因子对重组质粒载体CAT报告基因活性表达的影响，CAT基因活性检测采用ELISA试剂盒。结果成功构建了含有HPRE片段的重组质粒载体。转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达明显增强，而转染空载体的HepG2细胞仅有本底表达。IFN-γ和TNF-α对转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达的影响均具有浓度依赖性，而对空载体CAT活性的表达无影响。转染重组质粒的HepG2细胞在未加入细胞因子时，其CAT表达活性为896.5±213.6 pg/ml：加入IFN-γ、TNF-α及IFN-γ+TNF-α作用48h后，其CAT表达活性分别为324.4±56.8，395.8±82.3，175.3±35.6pg/ml，与未加入时比较，t=5.19，4.39，6.68，P＜0.01，差异有显著性。提示IFN-γ和TNF-α可能通过抑制HPRE的功能，调控乙型肝炎病毒基因的表达。 采用PCR反应产物直接测序法，对31例中国南方HBV感染者血清HBVDNA的HPRE片段扩增后测序，与Genbank中来源于欧美白种人群HBV感染者HBVDNA序列进行比较，并结合临床资料进行分析。结果显示前者HPRE的β_2区，存在3个位点变化，分别为1504nt(T→C)，占75.0％；1508nt(C→T)，占57.1％；C→G，占10.7％；1509nt(C→T)，占60.7％；在后者HPRE序列中均未发现上述位点变化。HPRE位点差异与HBVDNA水平未见明显相关。提示黄种人与白种人群HBV感染者的HPRE序列存在差异位点。 应用定点突变技术，体外构建含有HPRE位点变异的重组质粒载体，观察HPRE位点变异对HPRE功能以及细胞因子抗HBV机制的影响。经测序证实，成功构建了含有HPRE变异位点的重组质粒载体。与野生株比较，1504nt突变株的CAT活性明显升高，差异有显著性；1508nt突变株则无明显变化。在IFN-γ或/和TNF-α作用下，三种突变株的CAT活性均明显下 降，在正N一a作用下，1504nt突变株和巧以+1 508nt突变株的CAI，表达活 性明显降低，差异有显著性(P0.01);而1508nt突变株的C户a，表达活性无 明显变化(P0.05)。提示HPRE15O4nt位点变异可能影响HPRE功能，而 1508nt位点变异可能逃逸了正N一Q对HPRE的抑制作用。
【学位单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【部分图文】：

2.1HPRE·pDM138重组载体的鉴定HPRE一pDM138重组载体的测序由大连宝生生物工程公司完成。测序结果用DNASIS软件与标准序列比较分析，确定克隆成功，酶切鉴定结果见图2。234M000bP000bP500bP00bP366b250bP500bP000bPM:DNA相对分子质量标志;1，HPRE片段;2，酶切质粒;3，重组质粒;4，pDM138质粒图2重组质粒的PCR及酶切鉴定2.2转染效率的检测经液相闪烁计数仪检测，空载体与野生株的转染效
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 成军;乙型肝炎病毒基因异质性及准种特点研究的临床意义[J];解放军医学杂志;2002年02期

2 中华医学会传染病与,寄生虫病学分会,肝病学分会;病毒性肝炎防治方案[J];中华肝脏病杂志;2000年06期

3 邓庆丽,黄志明,邵静;HBV转录后调节元件结合蛋白克隆筛选和分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2000年06期

本文编号：2884194