hOP-1基因的克

发布时间：2020-11-15 15:11

　　 成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1，OP-1)又称骨形成蛋白-7(Bone Morphogenetic Protein，BMP-7)。最早由Ozkaynak发现，并于1990年将其基因克隆成功。随后对它的蛋白组成、生物学作用等有了深入的认识。OP-1属TGF-β超家族，与TGF-β家族成员有很高的同源性。人的OP-1基因位于第20号染色体上，其全长cDNA 1878bp，开放读框1296bp，编码431个氨基酸，由N端的信号肽、中间的前肽和C端的成熟肽构成。成熟而具有活性的OP-1，以二聚体糖蛋白形式存在。OP-1除具有BMP家族成员所特有的骨诱导功能外，还与牙齿发育，牙体、牙周组织的修复和矿化，造血系统以及神经系统等许多重要的生理功能有关。然而，由于天然来源的OP-1数量有限，对其功能研究及应用都受到了极大的限制，随着基因工程技术的发展，使大规模生产具有活性的OP-1重组蛋白质成为可能。 为了拓宽OP-1的研究与应用，通过基因工程技术，获得具有生物学活性的OP-1蛋白质，探讨其在牙齿发育、矿化中的作用机制，以及作为一种新的牙髓、牙周病治疗材料用于临床，促进修复性牙本质的形成和牙周组织再生等。本课题主要进行了以下几方面的研究： 一．OP-1成熟肽基因的克隆及多克隆抗体制备 本实验首先利用RT-PCR技术，从培养的人牙乳头细胞中，克隆出人OP-1成熟肽段基因，并在pEH4原核表达载体中获得高表达，表达量占菌体总蛋白的33％左右。将表达蛋白初步纯化，免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人OP-1多克隆抗血清，效价为1∶100000，为真核系统表达产物的免疫学检测及其OP-1的表达和功能研究创造了条件。 二．OP-1全长基因克隆及CHO细胞转染 在OP-1原核表达并制备多克隆抗血清的基础上，进行OP-1真核系统表达研究。通过获得的人牙乳头细胞总RNA，首次采用扩增高GC含量基因的PCR试剂盒，得到hOP-1约1300bp的全长段基因。序列测定正确后，插入pCI高效真核表达载体，并利用脂质体介导转染CHO细胞，
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2000
【中图分类】：R346
【部分图文】：

随机挑取转化生长的菌落，按质粒提取EeoRI和Sall进行双酶切，即在10林l酶(0.5协g一1.0件g)，相应的loxbueffrl协l，加重制性内切酶各0.5川，37”C温育lh，进行琼脂同时将所提质粒按1:100稀释后做为PC原PCR条件，再进行PCR扩增，琼脂糖凝胶2.8核昔酸序列分析将酶切和PCR扩增鉴定的阳性克隆提取质3.结果3.1总RNA提取将所提取的人牙乳头细胞总RNA进行琼8sl和5s三条带，分光光度计测定A26了A280=.0所获得的总RNA无明显的降解并且有较高的196林留ml。(图l)

PCR产物及重组质粒的酶切Lane1PCRMarkerLaneZ重组质粒酶切鉴定Lane3PCRrfagment组质粒进行核昔酸序列测定，一致(图4)。1)，具有很强的骨诱导作用，能进修复性牙本质，牙骨质的形、骨骼及胎盘等组织[’]，对胚胎观的临床应用前景[5]。已有文一1的表达，但有关在人牙胚发育

6hOP一1P/EH4表达载体的酶Lanel重组质粒酶切鉴定LnaeZ重组质粒L即e3DNAM肚ker大肠杆菌中的诱导表达重组阳性克隆，通过温度诱导目阳性克隆，经温度诱导后，SDS一蛋白(图7)。表达蛋白经薄层%(图8)。定血清抗体效价。按:1100;1:2P一1多克隆抗体，酶联免疫检测仪D值的最小浓度为102400:1。
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1 岳玲;hOP-1基因的克隆、多抗制备及其在真核细胞中的表达[D];第四军医大学;2000年

本文编号：2884895