粪肠球菌噬菌体IME-EF1的分离鉴定及其裂解酶的表达

发布时间：2017-05-30 22:12

  本文关键词：粪肠球菌噬菌体IME-EF1的分离鉴定及其裂解酶的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着抗生素的滥用现象日益严重，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素的研发速度远远赶不上耐药菌的产生速度，寻找新的抗菌制剂刻不容缓。而噬菌体及其裂解酶因其高效的杀菌能力及高度的宿主专一性而成为新一代抗菌制剂的候选之一，对于噬菌体及其裂解酶的研究在近些年被许多研究者提上日程。粪肠球菌是普遍存在于人或动物肠道、口腔及生殖道内的条件致病菌，可引起人的心内膜炎、菌血症、泌尿道感染及脑膜炎等疾病。在需氧革兰氏阳性菌导致的院内感染中，其致病率仅次于葡萄球菌，而多重耐药粪肠球菌所引起的疾病已经对人类健康造成极大威胁。 本研究就目前粪肠球菌的严重耐药性现状，利用临床分离的多重耐药菌，从医院污水中分离到一株可广泛裂解耐药粪肠球菌的噬菌体IME-EF1，分析研究其生物学特性并进行全基因组测序；克隆表达噬菌体裂解酶，验证其裂解活性及测定裂解谱；构建小鼠腹部粪肠球菌感染模型对噬菌体IME-EF1及其裂解酶的治疗效果进行评估。方法： 以临床分离的多重耐药粪肠球菌EF002为指示菌，采用噬菌斑实验从医院污水中分离噬菌体；利用双层平板培养法测定噬菌体IME-EF1效价,同时测定噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线；负染法透射电镜观察噬菌体形态；蛋白酶K/SDS法提取噬菌体基因组并酶切后电泳分析；ION TORRENT高通量测序仪测定噬菌体IME-EF1全基因组序列。 PCR扩增噬菌体IME-EF1裂解酶基因，克隆到pColdI表达载体进行诱导表达；采用点滴法与浊度法验证蛋白裂解活性及测定裂解谱；ELISA和Western blotting分析验证裂解酶蛋白表达与否及与敏感菌是否特异性结合。 给小鼠腹部注射最小致死量的粪肠球菌EF002，感染一段时间后，分组腹部注射噬菌体IME-EF1或其裂解酶进行治疗，记录小鼠死亡率及血液内细菌量，判断噬菌体及其裂解酶的治疗效果。 结果： 成功分离出一株噬菌体IME-EF1，该噬菌体能够裂解多株临床分离的粪肠球菌；电镜观察呈蝌蚪形，，最佳感染复数为1；通过绘制一步生长曲线证明该噬菌体感染后的潜伏期为25min，爆发期35min，裂解量60pfu。 成功表达噬菌体裂解酶蛋白Lysin-EF2。该蛋白能够裂解实验室现有的所有粪肠球菌，包括2株耐万古霉素粪肠球菌；可与敏感菌特异性紧密结合。 动物实验表明噬菌体IME-EF1及其裂解酶Lysin-EF2对于粪肠球菌所导致的感染具有较好的治疗效果，裂解酶治疗效果优于噬菌体；而在感染后及时有效的给药对于降低小鼠死亡率有一定意义。 结论： 随着粪肠球菌耐药性日趋严重，积极探索不依赖抗生素的治疗方法势在必行。研究结果表明利用临床分离的耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体，表达重组噬菌体裂解酶，并用于治疗细菌感染性疾病的方法是可行的，上述研究为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法打下了基础。
【关键词】：粪肠球菌 噬菌体 裂解酶 噬菌体治疗
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.1
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 1 粪肠球菌及其耐药现状13-14
• 2 噬菌体及其裂解酶的研究进展14-17
• 3 本研究的内容及方案17-18
• 第一部分 粪肠球菌噬菌体IME-EF1的分离鉴定及其生物学特性研究18-33
• 1 引言18-19
• 2 材料和方法19-25
• 3 结果25-30
• 4 讨论30-33
• 第二部分 噬菌体裂解酶 Lysin-EF2 的表达与活性检测33-54
• 1 引言33
• 2 材料和方法33-46
• 3 结果46-53
• 4 讨论53-54
• 第三部分 建立小鼠腹部感染治疗模型54-59
• 1 引言54
• 2 材料与方法54-56
• 3 结果56-57
• 4 讨论57-59
• 结论59-60
• 参考文献60-64
• 附录64-69
• 个人简历69-70
• 致谢70-71
• 综述71-80
• 参考文献77-80

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张红毅,G.E.Yousef,N.E.Bowles,L.C.Archard,G.F.Mann,J.F.Mowbray;用分子杂交法检测实验小鼠体内柯萨基B组病毒RNA[J];病毒学报;1989年03期

2 刘悦;李菁华;史红艳;温剑平;孙延波;;肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性[J];吉林大学学报(医学版);2012年01期

3 万学勤;唐冬生;刘爱平;谭淑仪;李万可兰;邝佳;李宏鸣;;幽门螺杆菌毒性噬菌体分离纯化及模拟治疗研究[J];南方医科大学学报;2011年02期

4 徐西雁,郭珍;核酸杂交技术在乙型肝炎病毒诊断中的应用[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1987年01期

5 张振生,买凯;核酸分子杂交技术及其在病毒感染诊断中的应用[J];河南医科大学学报;1989年01期

6 温占波;李劲松;;噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展[J];军事医学科学院院刊;2008年02期

7 钟敏;胡艳;;噬菌体治疗及其研究[J];江西畜牧兽医杂志;2011年04期

8 吴德芹;刘霄飞;刘文华;张灿;任慧英;;六株大肠杆菌噬菌体及其多克隆抗体的交叉抑制试验[J];青岛农业大学学报(自然科学版);2011年01期

9 马凤森;生物素标记核酸探针技术[J];生物化学与生物物理进展;1989年02期

10 孙盟盟;宋天一;胡士华;刘悦;孙延波;;奇异变形杆菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性分析[J];中国生物制品学杂志;2012年03期

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 张兵;基于ESTs的蛇毒腺和家猪脑组织基因表达研究以及噬菌体EH3-23P1全基因组序列分析[D];浙江大学;2006年

2 牛冬燕;应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠杆菌O157：H7的研究[D];大连理工大学;2009年

3 朱才众;布鲁氏菌噬菌体裂解酶基因表达、生物活性鉴定及裂菌动力学研究[D];第三军医大学;2009年

4 孙卫忠;铜绿假单胞菌噬菌体elys基因推定及功能验证[D];第三军医大学;2007年

5 郭婷婷;乳杆菌噬菌体及其裂解机制的研究[D];山东大学;2013年

6 于丹;金黄色葡萄球菌Al-2群体感应以icaR依赖的方式减弱生物膜形成[D];中国科学技术大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 王琳;铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性及整合位点的研究[D];第三军医大学;2006年

2 朱晓艳;摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因预测、克隆、表达及生物学活性的初步研究[D];第三军医大学;2009年

3 秦艳红;厦门港、波罗的海噬菌体—宿主系统的分离鉴定和利用荧光标记的噬菌体鉴别宿主细菌技术的初步研究[D];国家海洋局第三海洋研究所;2010年

4 杨扬;应用噬菌体防治弧菌引发的刺参腐皮综合征[D];大连理工大学;2013年

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本文编号：408059