人4-1BBL在K562细胞中的表达研究

发布时间：2017-06-01 16:03

  本文关键词：人4-1BBL在K562细胞中的表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：4-1BBL（CD137L）为Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，属于肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor，TNF）超家族。4-1BBL与其受体4-1BB结合形成4-1BB/4-1BBL复合物，作为一对重要的共刺激分子，广泛参与多种免疫细胞的激活。在细胞免疫过程中，T细胞增殖分化成效应细胞时，一方面需要抗原肽-MHC复合物介导的特异性的刺激，另一方面需要有协同刺激分子提供的第二信号。缺乏协同刺激分子提供第二信号，T细胞将进入无反应状态甚至调亡。因此，协同刺激分子提供的第二信号对于T细胞介导的细胞免疫应答不可或缺。4-1BBL是已知的协同刺激因子之一，对其进一步的研究对于了解协同刺激分子在细胞免疫中的作用有重要意义。 MICA是一种高度糖基化的跨膜糖蛋白，作为配体与其受体NKG2D结合在机体自然免疫中对NK细胞的激活起重要作用。NK细胞表面存在两种受体：杀伤细胞抑制性受体和杀伤细胞活化性受体。抑制性受体特异性识别细胞表面MHCⅠ类分子并使得正常的细胞免遭NK细胞的杀伤；NK细胞的活化性受体识别经典、非经典MHCⅠ类蛋白分子或MHCⅠ类相关蛋白分子，在NK细胞的活化的启动方面起关键作用。NKG2D是NK细胞重要的活化受体之一，其配基有非经典的MHCⅠ类分子蛋白A (MHC classⅠchain-related A，MICA)、 MHCⅠ类分子蛋白B(MHC classⅠ chain related B，MICB)。MICA存在于几乎所有人类上皮源性肿瘤中，MICA与其受体NKG2D的结合对于NK细胞杀伤肿瘤细胞起重要的作用。 克隆并构建人4-1BBL和MICA真核表达质粒并进行K562细胞的转染，对于进一步研究协同刺激分子在T细胞免疫中的作用机理和NK细胞激活中的免疫机制具有重要的理论意义，，对结合适应性免疫系统中T细胞免疫和天然免疫系统中NK细胞在抗病毒感染、抗肿瘤免疫治疗中有重要的指导价值。 本研究主要进行以下三方面的工作： 1重组人MICA真核表达质粒的构建 分离人外周血单个核细胞为材料，提取总RNA为模版进行RT-PCR获得人MICA基因，将其连接到真核表达载体pcDNA3.1/Hygro中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/Hygro-hMICA。对重组真核表达质粒测序结果进行鉴定。 2人4-1BBL真核表达载体的构建 以pORF-h4-1BBL v16为模版进行PCR获得人4-1BBL基因，将其导入双表达真核表达载体pVITRO2-neo-mcs中，构建重组真核表达质粒pVITRO-h4-1BBL。 3将成功构建的重组人真核表达质粒pVITRO2-h4-1BBL用脂质体介导的方式转染到K562细胞内。有限稀释法筛选阳性单克隆。流式细胞术鉴定表达4-1BBL的重组K562细胞单克隆。 综上，本实验成功构建了人真核表达质粒pcDNA3.1/Hygro-MICA和人真核表达质粒pVITRO2-h4-1BBL，并将重组真核表达质粒pVITRO2-h4-1BBL转染K562细胞，获得表达4-1BBL蛋白的重组K562细胞单克隆。
【关键词】：4-1BBL MICA K562 转染
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q78;R392.12
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-21
• 1.1 MICA 的概述12-15
• 1.1.1 MICA 的基因结构13
• 1.1.2 MICA 分子的表达调控13-14
• 1.1.3 MICA 的功能14
• 1.1.4 MICA 与肿瘤的关系14-15
• 1.2 4-1BBL 概述15-20
• 1.2.1 4-1BBL 的生物学特性15
• 1.2.2 4-1BBL 分子的表达15-16
• 1.2.3 4-1BBL/4-1BB 的信号传导特性16-17
• 1.2.4 4-1BBL/4-1BB 与免疫细胞的关系17-19
• 1.2.5 4-1BBL 与肿瘤细胞的关系19-20
• 1.3 立题依据20-21
• 第2章 hMICA 基因表达载体的构建21-32
• 2.1 材料和方法21-27
• 2.1.1 材料21-23
• 2.1.2 方法23-27
• 2.2 结果27-31
• 2.3 讨论31-32
• 第3章 4-1BBL 基因表达载体的构建/转染及表达鉴定32-45
• 3.1 材料和方法32-38
• 3.1.1 材料32-34
• 3.1.2 方法34-38
• 3.2 结果38-42
• 3.2.1 PCR 获取目的基因38-39
• 3.2.2 PMD18-T-h4-1BBL 克隆的构建及鉴定39
• 3.2.3 pVITRO-h4-1BBL 真核表达质粒的构建及鉴定39-41
• 3.2.4 G418 最佳筛选浓度的选择41
• 3.2.5 阳性转染细胞的鉴定41-42
• 3.3 讨论42-45
• 3.3.1 表达细胞的选择43
• 3.3.2 表达质粒的选择43
• 3.3.3 人工脂质体转染的优点43-44
• 3.3.4 阳性转染细胞的筛选44-45
• 第4章 研究总结45-46
• 4.1 本研究的实验结果45
• 4.2 拟进一步的研究方案45-46
• 参考文献46-50
• 致谢50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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2 王群,张利宁,肖东杰,丁培芳,宋静,孙汶生;人外周血树突状细胞的体外诱导培养及其表面CD137、CD137L的表达特点[J];山东大学学报(医学版);2003年04期

3 张锦英;居颂文;;CD137L分子在人肺癌细胞系A549上的表达及其生物学功能的研究[J];中国血液流变学杂志;2007年03期

4 张彩,冯进波,王郡甫,许晓群,张建,田志刚;膜型分泌型MICA对NK细胞受体NKG2D的相反调节效应及其对NK细胞受体谱的影响[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年02期

5 齐锦,彭萍,戴梦华,李勇海,崔莲仙,何维;MICA反应性Vδ1γδT细胞对上皮肿瘤细胞的细胞毒作用[J];中国医学科学院学报;2004年01期

  本文关键词：人4-1BBL在K562细胞中的表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：412937