人骨髓间充质干细胞衰老过程中DNA损伤应答特性研究

发布时间：2017-06-03 07:16

  本文关键词：人骨髓间充质干细胞衰老过程中DNA损伤应答特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：正常细胞受到Hayflick限制，不能发生无限增殖，衰老成为其最终结局，现有研究发现存在少部分细胞发生衰老逃逸，使这些基因组高度不稳定的衰老细胞发生癌变。干细胞作为成体组织细胞更新来源，具有生存周期长的特点，容易受到各种内外因素的作用，相比生命周期短的分化细胞受到更多的DNA损伤，容易导致损伤的大量积累，而干细胞具有强大的增殖和分化潜能，基因组的不稳定更易引发衰老和癌变。为保证基因组的稳定，防止恶性转化，细胞存在一个庞大的网络进行“纠错”，DNA修复就是其中一种重要机制。对DNA损伤应答机制的研究发现，如果细胞DNA损伤应答异常，同样会出现基因组不稳定现象，使细胞易发生衰老和恶性转化。已有文献报道，衰老细胞DNA损伤修复基因表达下调及核型异常，而在对基因敲除鼠和人类基因缺陷病患者的研究中，也发现DNA损伤修复基因缺失的细胞出现早衰现象。由此，我们认为细胞衰老与DNA损伤应答，以及肿瘤的发生具有密切联系。然而，衰老细胞的DNA损伤应答能力如何并无相关报道，所以我们提出推断：干细胞衰老过程中DNA损伤应答能力下降可能加速干细胞衰老并且使细胞功能下降，同时破坏细胞凋亡屏障，促发干细胞恶性转化。 目的： 以氧化损伤和DNA双链断裂损伤为模型，观察衰老细胞DNA损伤应答情况，探索DNA损伤应答异常是衰老细胞基因组不稳定性的直接原因。 方法： 1.培养人骨髓间充质干细胞，用流式细胞技术和定向诱导分化对细胞进行鉴定。2.衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况，BrdU掺入实验检测细胞增殖情况，，QPCR检测衰老相关基因，建立体外培养人骨髓间充质干细胞衰老模型。3.建立氧化损伤和DNA双链断裂损伤模型观察细胞DNA损伤和损伤后应答情况。通过CCK-8法检测细胞存活情况检测细胞对损伤的敏感性，DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧，单细胞凝胶电泳和γH2AX foci观察细胞DNA损伤和损伤后应答情况，QPCR检测参与损伤后应答相关基因的表达情况。 结果与结论： 1.人骨髓间充质干细胞经长期体外培养至40代以后，衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多，增殖能力明显下降，衰老相关基因表达增高，提示间充质干细胞长期培养后发生衰老。2.生存曲线结果显示H2O2作用下，年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞；活性氧及碱性单细胞凝胶电泳结果显示，衰老间充质干细胞对H2O2损伤更敏感，由H2O2引起的损伤应答能力降低，可能与氧化损伤应答基因的表达下调相关。3.生存曲线结果显示博来霉素（BLM）作用下，年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞；γH2AX foci及中性单细胞凝胶电泳结果显示，衰老间充质干细胞对BLM损伤更敏感，由BLM引起的损伤应答能力降低，可能与基因基础表达降低，应激反应滞后相关。
【关键词】：干细胞 干细胞体外培养与分化 骨髓间充质干细胞 衰老 DNA损伤修复 基因组稳定性 肿瘤 氧化损伤 衰老相关β-半乳糖苷酶 活性氧 单细胞凝胶电泳 γH2AX foci
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-7
• 摘要7-9
• 第一章 前言9-11
• 第二章 人骨髓间充质干细胞衰老模型的建立11-25
• 2.1 材料与方法11-16
• 2.2 结果16-22
• 2.3 讨论22-24
• 2.4 结论24-25
• 第三章 间充质干细胞衰老过程中 H2O2介导的 DNA 损伤应答特性的研究25-36
• 3.1 材料与方法25-29
• 3.2 结果29-34
• 3.3 讨论34-35
• 3.4 结论35-36
• 第四章 间充质干细胞衰老过程中 BLM 介导的 DNA 损伤应答特性的研究36-48
• 4.1 材料与方法36-40
• 4.2 结果40-46
• 4.3 讨论46-47
• 4.4 结论47-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-55
• 文献综述55-65
• 参考文献61-65
• 攻读硕士研究生期间撰写及待发表的论文65-66
• 致谢66

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本文编号：417544