表达小鼠GM-CSF的非复制型重组痘苗病毒的构建及其佐剂作用初步评价

发布时间：2017-09-06 10:07

  本文关键词：表达小鼠GM-CSF的非复制型重组痘苗病毒的构建及其佐剂作用初步评价

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【摘要】：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF)是一种细胞因子,可由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌。作为一种白细胞生长因子,GM-CSF可刺激干细胞向粒细胞(中性粒细胞、噬酸性粒细胞和噬碱性粒细胞)和单核细胞方向分化,在固有免疫中发挥重要的作用。90年代以来,在各类肿瘤治疗的研究中,GM-CSF作为一种佐剂由病毒载体单独表达或与一些肿瘤靶向基因、自杀基因或免疫调节分子由病毒载体共表达应用非常广泛[8-17]。它通过刺激树突细胞的招募、增殖和成熟从而提高对MHCI类和Ⅱ类限制性T细胞的抗原递呈[12,13],介导肿瘤破坏从而提高免疫治疗效果[15]。 病毒载体表达肿瘤相关抗原,可以提高其特异性免疫效果。一般应用的有以下几类肿瘤相关抗原：肿瘤相关的病毒抗原,癌胚抗原(Oncofetal Antigens)和突变的原癌基因或肿瘤抑制基因。但是,由于肿瘤是由自身正常组织发展而来,大多数肿瘤相关抗原不能被免疫系统视为外来抗原而被机体识别。然而,与肿瘤相关的病毒抗原是一种非常有前途的肿瘤相关抗原,因为它们仅在肿瘤组织中表达,而在正常组织中不存在。本研究采用的肿瘤相关抗原是人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)16型的E6、E7蛋白,它们正是这种特异性的肿瘤靶抗原。本科室对表达HPV16E6E7融合蛋白的非复制型痘苗病毒的小鼠免疫效果进行了研究,但发现其诱发的细胞免疫反应水平较低[7]。为了进一步提高该疫苗的免疫效果,可采用病毒载体表达一些细胞因子,使其发挥佐剂的作用。 因此,本论文选择非复制型痘苗病毒天坛株为载体,构建单独表达小鼠GM-CSF基因的重组非复制型痘苗病毒,通过与构建的HPV16E6E7重组痘苗病毒联合免疫,初步评价其对HPV16E7特异性的细胞免疫反应的影响,为痘苗病毒载体表达的GM-CSF作为佐剂的免疫效果研究奠定基础。 本研究获得以下主要结果： 一、成功构建了4个痘苗病毒天坛株重组质粒： ①pJSBH6LacZ,其H6启动子下带有LacZ基因。其余3个质粒都以它为载体基础上构建； ②pJSB75GMCSFH6LacZ,其7.5启动子下带有小鼠GM-CSF基因； ③pJSB11E67H6LacZ,其11启动子下带有HPV16E6E7融合基因； ④pJSB11E6775GMCSFH6LacZ,其7.5启动子下带有小鼠GM-CSF基因同时11启动子下带有HPV16E6E7融合基因。 二、成功构建了表达小鼠GM-CSF基因的重组非复制型痘苗病毒rNTVJGMCSFLacZ。经PCR产物测序和Western Blot鉴定,rNTVJGMCSFLacZ中正确插入了小鼠GM-CSF基因,并能分泌表达小鼠GM-CSF蛋白,而且小鼠GM-CSF具有体外生物学活性。遗传稳定性实验结果表明,rNTVJGMCSFLacZ中的小鼠GM-CSF基因稳定存在。 二、lNTVJGMCSFLacZ与RVVJE67联合免疫小鼠后,有增强特异性细胞免疫反应的趋势,对体液免疫反应的促进作用不明显。 总之,本论文以我国具有自主知识产权的非复制型痘苗病毒天坛株为载体,表达了有生物学活性的(GM-CSF,并在小鼠动物免疫实验中初步证明其有增强特异性细胞免疫的作用。为今后以表达GM-CSF的重组痘苗病毒作为佐剂的研究奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 技术路线12-13
• 第一部分 小鼠GM-CSF基因和HPV16 E6 E7融合基因的非复制型痘苗病毒天坛株重组质粒的构建和鉴定13-29
• 1 材料13-14
• 2 方法14-24
• 3 结果24-28
• 4 小结28-29
• 第二部分 表达小鼠GM-CSF基因的重组非复制型痘苗病毒天坛株的构建和鉴定29-43
• 1 材料29-30
• 2 方法30-37
• 3 结果37-42
• 4 小结42-43
• 第三部分 表达小鼠GM-CSF基因的重组非复制型痘苗病毒天坛株的佐剂效果初步研究43-50
• 1 材料43-44
• 2 方法44-47
• 3 结果47-49
• 4 小结49-50
• 全文结论50-51
• 参考文献51-53
• 文献综述53-61
• 参考文献58-61
• 作者简介61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 田厚文;任皎;黄薇;范江涛;赵莉;阮力;;表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建及免疫效果观察[J];病毒学报;2006年05期

2 马海伦,郭斐,孙朝晖,陆柔剑,张帆,阮力;非复制型多价重组痘苗病毒粘膜与细胞免疫效果[J];病毒学报;1999年01期

3 马海伦,孙朝晖,陆柔剑,娄元梅,郭斐,张帆,阮力;同时表达多种外源基因的非复制型重组痘苗病毒的构建[J];病毒学报;1999年01期

4 金奇,陈南海,陈淑霞,黄静,冯泽华,袁劲松,金冬雁,白宏东,侯云德;痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析[J];中国科学C辑:生命科学;1997年06期

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本文编号：802490