泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测

发布时间：2017-09-06 17:03

  本文关键词：泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测

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【摘要】：目的：泛素特异性蛋白酶（ubiquitin specific protease, usp）26基因位于X染色体q26.2区域，基因编码区由一个外显子构成，含2794个碱基，编码913个氨基酸，推测其蛋白质分子量约104KDa。Usp26基因属于去泛素化酶家族（deubiquitinating enzymes，DUBs），去泛素化酶在泛素蛋白酶体途径发挥多个作用，包括多聚泛素链的分离，将被泛素化的蛋白上的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛素残基促进蛋白酶体的降解作用和泛素的再利用，进而调节蛋白的活性或其降解。Usp26由wang等首次报道，分离自小鼠精原细胞。在人和小鼠中，usp26在睾丸组织特异性表达。但是目前对于usp26基因的生理机制和分子途径并不十分清楚。最近有一些研究指出，usp26基因多态性可能与男性不育相关。Dirac AM等的研究提示USP26在雄激素受体信号传导途径中的作用可能与其去泛素化酶活性有关。因此，我们通过检测usp26几种突变型的去泛素酶活性变化，研究usp26基因的几种突变型对其去泛素化活性的影响，为usp26的分子途径和生理功能提供线索，同时为研究usp26基因与男性不育症的关联性研究奠定基础。 方法： 1质粒的构建。野生型usp26基因由荷兰研究者Annette M.G. Dirac提供。利用野生型usp26基因为模版，进行PCR扩增，引入BamHI酶切位点，以便后续构建质粒。引物序列：上游引物为5’-GGATCCATGGCTGCCCTATTCCTAC-3’，下游引物为5’-GGATCCTTATTCCTTCTGAAGGGTCTCC-3’。PCR产物纯化回收后进行BamHI位点酶切反应，连接到pGEX-6p-1中。构建的质粒pGEX-usp26最后进行测序鉴定。将pET-3d质粒的T7启动子以BglII和HindIII酶切位点切下，与BamHI及HindIII处理的pACYC184质粒进行连接，确保T7启动子处于阅读编码框内。将已构建的pGEX-usp26中的usp26基因以BamHI酶切位点切下，连入pAC-T7中。将构建的pAC-T7-usp26质粒进行测序鉴定。 2定点突变。利用定点突变的方法构建5个SNP：468GT、1274CT、2144AT、2204TG、2239AT突变型及CS无活性突变型911GC。分别以特异性引物进行定点突变PCR反应，反应条件95℃预变性30sec，95℃变性30sec，55℃复性1min，68℃延伸10min，18次循环，最后72℃延伸5min。 3去泛素化酶活性分析。采用模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal进行去泛素化酶活性分析。质粒pACYC-usp46和pAC-T7分别作为阳性对照和阴性对照。将pAC-T7-usp26野生型、pAC-T7-usp26突变型、pACYC-usp46及pAC-T7分别与pGEX-Ub52共转化入BL21细菌中，IPTG诱导蛋白表达。细菌超市破碎后，将底物GST融合蛋白用GSH-Sepharose Resin纯化后，10%SDS PAGE电泳检测。另一模型底物Ub-Met-β-gal检测体系，采用pGEX-usp46和pGEX-6p-1分别作为阳性和阴性对照。pGEX-usp26野生型、pGEX-usp26突变型、pGEX-usp46及pGEX-6p-1分别与与pAC-M-β-gal共表达与BL21细菌中，IPTG诱导表达后，采用小鼠β-gal抗体及兔抗小鼠荧光抗体进行蛋白质印迹分析。采用Odyssey双色红外激光成像系统进行结果收集。 结果： 1定点突变：对测序结果进行序列分析证实定点突变成功突变位点468GT,1274CT,2144AT,2204TG,2239AT及911GC。 2USP26具有去泛素化酶活性：为检测USP26去泛素化酶活性，将其分别与模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表达与BL21细菌中。USP46与GST-Ub52共表达后，GST-Ub52被去泛素化，，产生分子量约36KDa的产物。野生型USP26与USP46一样具有去泛素化酶活性，其活性较之USP46更为显著。与预期一致，USP26CS突变型失去去泛素化酶活性。用模型底物Ub-Met-β-gal进行去泛素化酶活性分析发现，结果与GST-Ub52模型底物的分析一致。 3USP26的5个SNP活性检测：为检测USP26468GT，1274CT，2144AT，2204TG及2239AT突变去泛素化酶的活性，将各个突变质粒分别与模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表达于BL21细菌中。与GST-Ub52共表达后，468GT，1274CT，2144AT，2204TG及2239AT突变株，与野生型一样，GST-Ub52被去泛素化，产生分子量约36KDa的产物。用模型底物Ub-Met-β-gal进行去泛素化酶活性分析的结果与GST-Ub52模型底物的分析一致，总之，此5种突变型未影响USP26的去泛素化酶活性。 结论： 1通过定点突变PCR，成功突变usp26基因5种SNP突变位点。 2GST-Ub52及Ub-Met-β-gal模型底物检测去泛素化酶活性体系可有效检测USP26的去泛素化活性。 3野生型USP26具有显著的去泛素化酶活性。当USP26活性关键位点第304位半胱氨酸被丝氨酸取代后，USP26失去去泛素化酶活性。 4Usp26基因的五个SNP：468GT、1274CT、2144AT、2204TG、2239AT，并未影响USP26的去泛素化酶活性。
【关键词】：泛素特异性蛋白酶 USP26 单核苷酸多态性 基因表达 去泛素化酶活性
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11
• 材料与方法11-19
• 结果19-22
• 附图22-27
• 讨论27-28
• 结论28
• 参考文献28-32
• 综述 泛素特异性蛋白酶 USP26 的研究进展32-41
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 个人简历42

【参考文献】

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1 张洁;邵小光;史艳彬;鄢磊;王磊;田宏;邱曙东;;泛素特异蛋白酶26基因多态性与特发性男性不育症的相关性研究[J];中华男科学杂志;2012年02期

本文编号：804343