ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选

发布时间：2017-09-07 22:20

  本文关键词：ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选

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【摘要】：本研究旨在通过运用核糖体展示技术,在鼠源性单链抗体库中筛选出抗ICOSL的特异性抗体,以期在减轻器官移植的排异反应方面能有更广阔的应用。 第一,通过RT-PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。 第二,以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb/c、鼠,每两周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker (VH-linker)序列,以及轻链可变区和Linker (Vκ-linker)序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH/κ与pMD19-T载体链接产物转化E. coli DH5a, PCR鉴定并测序。 第三,通过核糖体展示技术,使抗ICOSL单链抗体库经过体外翻译,形成“单链抗体—核糖体—mRNA"三元复合物。并用BAFF-His蛋白进行负筛,再将ICOSL蛋白做抗原,进行3轮正筛,从而获得抗ICOSL的特异性单链抗体基因序列,并将此序列嵌入到PET43.1a表达载体中进行蛋白表达。 最后,对表达出来的蛋白进行间接ELISA检测,从而筛选出高效表达目的蛋白的克隆菌株。将表达产物经镍柱纯化得到抗ICOSL单链抗体,并经Western blot检测其特异性。 本研究以重组ICOSL胞外区蛋白为抗原构建抗ICOSL单链抗体库,并通过核糖体展示筛选获得单链抗体,经过特异性与活性的检测,我们成功的筛选得到了对ICOSL具有高亲和的单链抗体。为抗ICOSL单链抗体的人源化改造,并利用其治疗器官移植引起的急慢性排异反应奠定基础。
【关键词】：ICOSL 核糖体展示 单链抗体 急慢性排异反应
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词表3-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 参考文献12-13
• 第一部分 文献综述13-43
• 第一章 ICOSL的研究进展14-23
• 1.1 ICOSL及其受体ICOS的结构14-16
• 1.2 ICOSL的分布与表达16
• 1.3 ICOSL的生物学功能及其信号传导的研究16-18
• 1.4 ICOSL在疾病方面的研究18-20
• 1.4.1 ICOSL对自身免疫性疾病的影响18-19
• 1.4.2 ICOSL对器官移植排异反应的影响19-20
• 参考文献20-23
• 第二章 单链抗体的表达及应用23-33
• 2.1 单链抗体的构建及其生物学特性23-24
• 2.1.1 单链抗体的构建23
• 2.1.2 单链抗体的生物学特性23-24
• 2.2 单链抗体的表达系统24-26
• 2.2.1 原核细胞表达系统24-25
• 2.2.2 哺乳动物细胞表达系统25
• 2.2.3 酵母细胞表达系统25-26
• 2.2.4 植物细胞表达系统26
• 2.2.5 昆虫细胞表达系统26
• 2.3 单链抗体的应用26-29
• 2.3.1 在生物学方面的应用26-27
• 2.3.2 在基因治疗方面的应用27
• 2.3.3 在肿瘤诊断方面的应用27-28
• 2.3.4 在肿瘤治疗方面的应用28-29
• 2.3.5 在抗器官移植排异反应方面的应用29
• 2.4 单链抗体的前景与展望29-30
• 参考文献30-33
• 第三章 核糖体展示技术的建立及应用33-43
• 3.1 核糖体展示技术概述33-34
• 3.2 核糖体展示技术的原理34
• 3.3 核糖体展示技术的具体过程34-38
• 3.3.1 核糖体展示基因文库的构建35-36
• 3.3.2 核糖体展示技术中的体外转录与翻译36-37
• 3.3.3 核糖体展示技术中的亲和筛选与筛选效率的测定37-38
• 3.4 核糖体展示技术的应用38-39
• 3.4.1 在多肽筛选方面的应用38-39
• 3.4.2 在筛选抗体方面的应用39
• 3.4.3 在酶方面的应用39
• 3.5 核糖体展示技术的应用前景及展望39-41
• 参考文献41-43
• 第二部分 实验研究43-73
• 第一章 ICOSL分子胞外区的克隆表达44-53
• 摘要44-45
• Abstract45-46
• 1 材料与方法46-48
• 1.1 实验材料与试剂配置46
• 1.2 试验方法46-48
• 2 结果与分析48-50
• 2.1 ICOSL基因全长的扩增48-49
• 2.2 ICOSL胞外区基因的扩增49
• 2.3 ICOSL胞外区基因的克隆与表达49-50
• 3 讨论50-52
• 参考文献52-53
• 第二章 抗ICOSL核糖体展示单链抗体库的构建53-62
• 摘要53-54
• Abstract54-55
• 1 材料与方法55-58
• 1.1 实验材料与试剂配置55
• 1.2 试验方法55-58
• 2 结果与分析58-59
• 2.1 ELISA分析58
• 2.2 小鼠脾脏总RNA的提取58-59
• 2.3 VH-linker、VK-linker链以及VH-linker-κ链的扩增59
• 3 讨论59-61
• 参考文献61-62
• 第三章 核糖体展示技术筛选抗ICOSL单链抗体62-73
• 摘要62-63
• Abstract63-64
• 1 材料与方法64-67
• 1.1 实验材料64-65
• 1.2 试验方法65-67
• 2 结果与分析67-70
• 2.1 体外转录与翻译67
• 2.2 单链抗体基因的亲和性鉴定67-68
• 2.3 单链抗体的表达纯化及活性坚定68-69
• 2.4 克隆菌株的序列分析69-70
• 3 讨论70-72
• 参考文献72-73
• 全文结论73-74
• 致谢74-75
• 附录75
• 攻读硕士期间发表论文75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 武国军,郝晓柯;单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断、治疗中的应用[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);1999年01期

2 李文秀;周凤云;毛伟平;潘杨滨;何志娟;徐，

本文编号：810221