羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究

发布时间：2017-09-08 12:45

  本文关键词：羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究

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【摘要】：目的：1.从人足月胎盘羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞，建立相应培养体系，体外共培养两种细胞探究两者二维共培养中的相互影响关系。2.分析鉴定羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC）和羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells, hAEC)的干细胞特性以及羊膜上皮细胞作为组织工程皮肤表层种子细胞与人皮肤角质形成细胞的相似性。3.通过三维气液培养以羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤。 方法：取人足月剖宫产胎儿胎盘机械剖离羊膜，通过胰酶、胶原酶分步消化分离培养人羊膜间充质干细胞（hAMSC）、羊膜上皮细胞（hAEC)，通过流式细胞分析术鉴定两种细胞CD90等表型情况，通过RT-PCR检测基因CMYC等的表达情况以鉴定hAMSC与hAEC在基因表达水平的干细胞特性，同时RT-PCR检测hAEC、hKRT19等基因的表达，免疫荧光染色检测hAEC K14的表达情况以鉴定其与人皮肤角质形成细胞的相似性同时说明其作为组织工程皮肤种子细胞的可行性。将两种细胞按一定比例进行二维混合培养，绘制细胞生长曲线，研究两者二维共培养中的相互影响关系。最后以鼠I型胶原为基质用两种细胞气液三维培养构建组织工程皮肤，HE染色切片观察。 结果：（1）成功分离培养了hAMSC和hAEC，体外共培养实验中hAEC生长状态良好具有较快的增殖速度，表型无明显改变；（2）流式细胞术检测体外培养hAMSC和hAEC均高表达CD90、CD73、CD105，不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-II类分子HLA-DR。RT-PCR检测到hAMSC表达干细胞特性基因CMCY和NANOG，hAEC表达干细胞特性基因CMCY和KLF4，RT-PCR检测hAMSC表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8，，hAEC表达K19、β1-integrin、K5、K8，免疫荧光染色见hAEC表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14；(3)通过气液培养利用两种细胞成功构建组织工程皮肤，HE染色切片显示其具有一定的皮肤结构，且hAEC发生了初步分化。 结论：hAMSC与hAEC均有一定的干细胞特性，hAEC与皮肤角质形成细胞更具相似性，在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。共培养结果显示在三维工程皮肤的培养中生长于基质部分的hAMSC对表层的hAEC可以起到一定的滋养作用。本研究通过气液培养成功构建了组织工程皮肤，证实了hAMSC与hAEC通过三维培养构建人工皮肤组织是可行的。
【关键词】：组织工程皮肤 羊膜间充质干细胞 羊膜上皮细胞 共培养 分化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-13
• 第一部分 人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的体外分离培养与生物学特性鉴定13-26
• 材料与方法13-18
• 结果18-23
• 讨论23-26
• 第二部分 人羊膜间充质干细胞与人羊膜上皮细胞体外共培养并构建组织工程皮肤26-38
• 材料与方法26-29
• 结果29-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-46
• 综述：人胎膜来源干细胞的研究进展46-59
• 参考文献55-59
• 攻读学位期间发表的论文59-60
• 缩略词表60-61
• 致谢61-62

【参考文献】

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本文编号：814122