MVA-Ag85B-TB10.4和MVA-tPA-Ag85B-TB10.4结核疫苗的构建及免疫原性研究

发布时间：2017-09-09 17:38

  本文关键词：MVA-Ag85B-TB10.4和MVA-tPA-Ag85B-TB10.4结核疫苗的构建及免疫原性研究

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【摘要】：结核病作为一种人类疾病大约出现在70000年前的非洲，而其病原体结核分枝杆菌也被发现超过一个世纪。但如今，，结核病仍然是困扰人类的一个重大疾病。据世界卫生组织统计，2012年，全世界新增860万结核病患者，并有130万人因结核病而死亡。目前唯一被广泛应用的结核杆菌疫苗卡介苗，对于成人的保护效果并不好，所以新型有效结核疫苗的研发迫在眉睫。结核杆菌有众多的分泌蛋白，其中一些已被证明具有良好的免疫原性，并在一些疫苗中得到了应用。Ag85B蛋白即为一种被众多新型结核疫苗采用的抗原蛋白，是Fbp蛋白家族中的一员，能够帮助分枝杆菌粘附到粘膜表面，从而促进其进入宿主细胞。TB10.4是ESAT 6家族中的一员，其是分枝杆菌铁、锌离子的摄入通道，为结核分枝杆菌的生长所必需。病毒载体在目前的疫苗研究中也越来越被重视，其中痘病毒载体由于其良好的免疫原性和优秀的安全性，被认为是很好的候选疫苗载体。 本研究中，应用痘病毒载体MVA构建了表达Ag85B TB10.4融合蛋白的重组结核疫苗MVA Ag85B TB10.4。并为了提高蛋白的表达量，通过在Ag85B TB10.4的N端引入组织纤溶酶原激活因子前导信号肽tPA，构建了MVA tPA Ag85B TB10.4，以期产生更好的免疫效果。具体的研究内容如下： 第一，通过PCR得到Ag85B TB10.4和含有tPA信号肽、HA标签的Ag85B TB10.4基因，将其连接到pcDNA3.1( )表达载体上，将质粒转染入293T细胞中，检测表达量。Western Blot检测结果表明，Ag85B TB10.4基因在细胞内能够正常表达，同时tPA信号肽对蛋白表达量的提高有明显作用。 第二，将Ag85B TB10.4基因和tPA Ag85B TB10.4基因通过穿梭质粒pSC11M1重组到MVA中，筛选得到MVA Ag85B TB10.4和MVA tPA Ag85B TB10.4两个病毒株。通过对感染的BHK TK 细胞进行Western Blot检测，证明重组病毒株能够正常表达外源蛋白。 第三，将两株病毒扩增纯化，检测滴度后，免疫Balb/c小鼠，另免疫MVA Blank和PBS作为对照组。两次免疫后检测细胞免疫应答效果。结果显示，抗原蛋白和肽刺激后， MVA Ag85B TB10.4诱导产生了较弱的IFN γ分泌，而MVA tPA Ag85B TB10.4无论在全蛋白刺激下，还是各种表位肽刺激下产生的IFN γ都要远远高于MVA Ag85B TB10.4，证明tPA信号肽的修饰对疫苗免疫后的应答水平有较好的增强作用。 本研究对MVA Ag85B TB10.4和MVA tPA Ag85B TB10.4两种结核疫苗的免疫效果进行了考察，初步证实了tPA信号肽对于免疫应答有增强效果。但在tPA信号肽的具体作用机制及疫苗的保护效果等方面，仍需进一步的研究。
【关键词】：结核疫苗 Ag85B TB10.4 MVA tPA信号肽
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 结核病简介12-14
• 1.1.1 结核病与结核分枝杆菌12
• 1.1.2 结核病的现状12-14
• 1.2 结核分枝杆菌14-18
• 1.2.1 结核分枝杆菌特点14-15
• 1.2.2 结核杆菌感染过程15-16
• 1.2.3 结核分枝杆菌的毒力因子16-18
• 1.2.3.1 Ag85B16-17
• 1.2.3.2 TB10.417-18
• 1.3 结核疫苗现状18-20
• 1.4 tPA 信号肽20
• 1.5 本研究的设计思路20-21
• 第2章 重组质粒构建与真核表达21-33
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验仪器21
• 2.1.2 质粒与酶21
• 2.1.3 试剂与溶液配制21-23
• 2.1.3.1 菌种培养及保存相关溶液21-22
• 2.1.3.2 抗生素溶液22
• 2.1.3.3 琼脂糖凝胶电泳溶液22
• 2.1.3.4 SDS-PAGE 凝胶电泳所用试剂22-23
• 2.1.3.5 Western-Blot 试剂23
• 2.2 实验方法23-28
• 2.2.1 序列设计23-25
• 2.2.2 PCR 扩增目的片段25-26
• 2.2.3 重组 p-GEM-T-easy 克隆载体的构建26-27
• 2.2.4 重组 pcDNA3.1(-)与 pSC11M1 质粒构建27
• 2.2.5 真核表达重组pcDNA3.1(-)质粒27-28
• 2.3 实验结果28-31
• 2.3.1 PCR 扩增目的片段结果28
• 2.3.2 重组 p-GEM-T-easy 克隆质粒结果28-29
• 2.3.3 重组 pcDNA3.1(-)与 pSC11M1 质粒结果29-30
• 2.3.4 真核表达 Western-Blot 结果30-31
• 2.4 本章小结31-33
• 第3章 重组 MVA 载体疫苗的制备33-42
• 3.1 实验材料33-34
• 3.1.1 实验仪器33
• 3.1.2 试剂33
• 3.1.3 细胞系与病毒株33-34
• 3.2 实验方法34-38
• 3.2.1 MVA 重组34
• 3.2.2 重组 MVA 的筛选34-35
• 3.2.3 重组 MVA 的检测35-36
• 3.2.3.1 PCR 检测35-36
• 3.2.3.2 Western-Blot 检测36
• 3.2.4 重组 MVA 的扩增36-37
• 3.2.5 重组 MVA 的纯化37
• 3.2.6 重组 MVA 滴度的测定37-38
• 3.3 实验结果38-41
• 3.3.1 MVA 重组检测38
• 3.3.2 重组 MVA 的筛选检测结果38-40
• 3.3.3 重组 MVA 蛋白表达量检测40
• 3.3.4 MVA 病毒滴度检测40-41
• 3.4 本章小结41-42
• 第4章 重组 MVA 病毒的免疫原性研究42-53
• 4.1 实验材料42-43
• 4.1.1 实验动物42
• 4.1.2 仪器试剂42-43
• 4.2 实验方法43-47
• 4.2.1 动物免疫方案43
• 4.2.2 脾淋巴细胞分离43-44
• 4.2.3 T 细胞亚群分群44-45
• 4.2.4 T-cell 增殖及细胞因子检测45
• 4.2.5 ELISPOT 检测刺激后脾细胞 IFN-γ的分泌45-46
• 4.2.6 CTL 体外细胞杀伤实验46-47
• 4.3 实验结果47-52
• 4.3.1 CTL 体外杀伤实验结果47-48
• 4.3.2 ELISPOT 检测 IFN-γ的分泌48-50
• 4.3.3 FCM 检测 T 细胞亚群分布50-52
• 4.4 本章小结52-53
• 第5章 结论53-55
• 5.1 讨论53-54
• 5.2 结论54
• 5.3 展望54-55
• 参考文献55-57
• 致谢57

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