DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响

发布时间：2017-09-09 22:05

  本文关键词：DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响

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【摘要】：为了研究同源结构域转录因子家族成员DLX1对间充质干细胞成骨分化的影响,骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic proteins9,BMP9）作用于小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs和小鼠成肌细胞C2C12，通过PCR和Western Blot检测发现BMP9可以促进DLX1的mRNA水平和蛋白水平表达。过表达DLX1的重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞、iMEFs细胞和C2C12细胞，在此基础上再用BMP9腺病毒的条件培养基处理细胞，分别利用化学发光法和染色法定量和定性地检测早期的成骨分化指标碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）的活性，发现BMP9可以促进细胞的ALP活性升高，并且在C3H10T1/2细胞中，DLX1可以促进BMP9诱导的细胞ALP的活性。值得注意的是，在iMEFs细胞中，虽然BMP9可以诱导其ALP活性升高，但是DLX1对BMP9的诱导作用却没有明显影响。而对C2C12细胞而言，BMP9诱导的ALP活性会受到DLX1的抑制。用同样的处理方式作用于C3H10T1/2细胞，分别使用Western Blot和PCR检测成骨指标Osteopontin（OPN）和Osteocalcin（OCN）的表达情况。结果显示，BMP9可以促进OPN和OCN的表达，而DLX1能进一步增强BMP9对其表达的诱导作用。同样的方法处理C3H10T1/2细胞和iMEFs细胞后，通过茜素红染色检测晚期成骨指标钙盐沉积，发现BMP9可以诱导细胞的钙盐沉积增多，而且DLX1可以增强BMP9对其的诱导作用。为了进一步验证DLX1对成骨分化的作用，采用腺病毒DLX1感染C3H10T1/2细胞，在BMP9的作用下，利用PCR技术检测成骨分化的标志性基因inhibitor of deifferentiation1（Id1）、Id2、Id3、Osterix、osteoprotegerin（OPG）、DLX5、connective tissue growth factor（CTGF）和Runt-related transcription factor2（Runx2）的表达，，发现BMP9均可诱导靶基因的表达，并且DLX1可以促进BMP9对靶基因表达的诱导作用。DLX1腺病毒和BMP9条件培养基作用于C3H10T1/2细胞后，通过检测荧光素酶报告基因的活性和Western Blot来探索DLX1与Smad信号通路之间的关系。结果发现，DLX1和BMP9均可以增强Smad荧光素酶报告基因的活性，并且DLX1可以促进BMP9的作用；Western印迹显示，DLX1不影响BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化水平，两者对总蛋白水平没有影响。为了更全面地验证DLX1对间充质干细胞成骨分化的影响，构建了4个DLX1的siRNA质粒并将其成功包装成腺病毒，用此腺病毒分别感染C3H10T1/2细胞，利用PCR和Western Blot验证其干扰是否有效，结果表明这4种腺病毒均能有效地干扰DLX1的表达。4种腺病毒采用不同感染效率的剂量分别处理C3H10T1/2细胞，在BMP9作用的基础上，应用化学发光法和染色法检测成骨分化指标ALP的活性。结果发现，在4种siRNA腺病毒中，有两种在低感染效率和高感染效率时对C3H10T1/2细胞中由BMP9诱导的ALP活性的作用不同：低感染效率时可以促进其ALP活性，而高感染效率时对其活性的影响则表现为抑制。其他两种腺病毒对C3H10T1/2细胞中BMP9诱导的ALP活性的影响均表现为抑制。上述结果表明DLX1能够促进由BMP9所诱导的间充质干细胞的成骨分化，而干扰DLX1会影响BMP9的这种作用。对Smad1/5/8的荧光素酶报告基因活性检测和Western Blot的结果分析表明，DLX1影响BMP9诱导的间充质干细胞的成骨分化作用可能是通过影响Smad1/5/8的转录活性来实现的。
【关键词】：DLX1 骨形态发生蛋白9 间充质干细胞 成骨分化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-14
• 1 材料和方法14-23
• 2 结果23-33
• 3 讨论33-37
• 全文总结37-38
• 参考文献38-42
• 文献综述42-51
• 参考文献47-51
• 致谢51-52
• 攻读硕士期间发表的学术论文52-53

【共引文献】

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本文编号：823012