小凹蛋白-1对毒胡萝卜素诱导的RAW264.7细胞内质网应激凋亡途径机制的研究

发布时间：2017-09-10 19:33

  本文关键词：小凹蛋白-1对毒胡萝卜素诱导的RAW264.7细胞内质网应激凋亡途径机制的研究

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【摘要】：目的 本研究通过观察小凹蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)对毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)诱导的RAW264.7细胞凋亡以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达的调节作用，探讨Cav-1与细胞内质网应激凋亡途径的相互作用，并进一步探讨凋亡相关蛋白的作用及其分子机制，为Cav-1抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的机制研究提供新的干预靶点。 方法 1.巨噬细胞RAW264.7内质网应激模型的建立：分别以0.3、1、3μmol/L三个浓度的TG与RAW264.7细胞共同培养，于12、24、36、48h四个时间点检测细胞存活率，以存活率50%作为巨噬细胞凋亡的标志，选择经TG诱导制备RAW264.7细胞内质网应激模型的适宜时间和浓度。 2.siRNA技术沉默细胞Cav-1表达：用脂质体导入法将cav-1siRNA导入RAW264.7细胞，孵育48-96h后采用western blot法检测Cav-1的表达，筛选Cav-1蛋白表达下降75%以上的细胞作为成功转染的细胞（称作Cav-1-siRNA），并确定最佳转染条件。 3.检测Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激凋亡的影响：实验分为正常对照组、模型组、 Cav-1siRNA组、 Cav-1siRNAsiRNA+TG组。 AnnexinV-FITC/PI双染法在流式细胞仪(flow cytometry, FCM)上检测各组细胞凋亡率； 4.检测Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激相关基因Bcl-2和Bcl-xl的mRNA含量的影响：沉默细胞Cav-1基因表达，采用半定量PCR法检测各组细胞中Bcl-2和Bcl-xl的mRNA变化,分析Cav-1是否影响RAW264.7细胞内质网应激反应中Bcl-2、Bcl-xl基因的mRNA水平。 5.检测Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达的影响：RAW264.7细胞中Cav-1被沉默前后，采用免疫印迹法(western blotting)检测各组细胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达水平的变化，继续探讨Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激反应中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达的调节作用。 结果 1.巨噬细胞内质网应激模型的建立：1μmol/L的TG与RAW264.7细胞共同培养24h，细胞存活率为42.07±3.35%，根据存活率50%作为细胞凋亡的标志，此时细胞已转变为凋亡细胞。因此，选择1μmol/L的TG作用RAW264.7细胞24h建立内质网应激凋亡细胞模型，进行后续实验。 2. siRNA技术沉默细胞Cav-1表达效果：将siRNA导入RAW264.7细胞孵育48h后采用western blot法检测Cav-1的表达,与正常组及阴性对照组相比均下降80%，将成功转染的细胞进行后续实验。 3. Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激凋亡的影响：抑制了RAW264.7细胞Cav-1表达后，cav-1-siRNA能够促进TG诱导的RAW264.7细胞内质网应激损伤，与TG组相比，细胞凋亡率升高(P0.05)。 4. Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl mRNA的影响：半定量PCR结果显示，，Cav-1被沉默后可明显下调TG诱导的RAW264.7细胞凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的mRNA含量，且比较结果有显著性差异(P0.05)。 5. Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl蛋白表达的影响：western blotting检测Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表达，结果显示沉默RAW264.7细胞Cav-1的表达后，Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表达较对照组明显下降(P0.05)。 结论 1.Cav-1基因沉默后可增加TG诱导的RAW264.7细胞内质网应激凋亡损伤，由此得出TG诱导的RAW264.7细胞内质网应激凋亡中Cav-1对其具有抑制作用； 2.Cav-1在TG诱导的RAW264.7细胞内质网应激过程中可增加Bcl-2和Bcl-xl的表达，由此表明Cav-1对RAW264.7细胞内质网应激凋亡途径的抑制作用与Bcl-2和Bcl-xl信号通路有关。
【关键词】：小凹蛋白-1 Bcl-2 Bcl-xl 内质网应激 凋亡 巨噬细胞 动脉粥样硬化
【学位授予单位】：泰山医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 符号说明10-11
• 前言11-16
• 材料与方法16-36
• 结果36-38
• 讨论38-43
• 结论43-44
• 附表44-47
• 参考文献47-53
• 综述53-60
• 参考文献57-60
• 致谢60-61
• 攻读学位期间发表的学术论文61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 丁培杰;杨书钦;曹明瑞;臧文巧;陈宗德;赵国强;;人血管内皮生长因子mRNA靶向siRNA表达载体的构建和表达[J];郑州大学学报(医学版);2007年02期

2 覃丽;秦旭平;王佐;朱炳阳;廖端芳;;普伐他汀对泡沫细胞内胆固醇酯的影响及与小凹蛋白-1的关系[J];生理学报;2006年01期

本文编号：826214