卵巢癌顺铂耐药裸鼠模型的构建及差异因子筛选

发布时间：2017-09-11 04:07

  本文关键词：卵巢癌顺铂耐药裸鼠模型的构建及差异因子筛选

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【摘要】：目的建立一种铂类耐药性稳定人卵巢上皮癌(EOC)的裸鼠移植瘤模型,分析其抵抗顺铂的生物学特性及其分子机制,并在基因水平和蛋白水平上动态的研究卵巢癌顺铂耐药相关分子,为研究体内微环境耐药机制及逆转靶点基因筛选奠定基础。 方法GFP标记的EOC细胞株SKOV3-GFP在体外培养或在裸鼠皮下注射,经DDP诱导后建成SKOV3/DDP i和SKOV3/DDP ii,将这两株细胞再种植于裸鼠皮下经再次的DDP诱导分别建成两株顺铂(DDP)耐药的EOC细胞株SKOV3/DDP Ⅰ和SKOV3/DDPⅡ,检测它们的DDP半数抑制浓度(IC50值),动态分析用药浓度与细胞周期、凋亡和胞内药物浓度关系。体内动态观察移植瘤细胞亚结构改变和耐药相关基因PTEN. STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1基因表达。应用Ⅲumina表达谱芯片和Itraq标记的定量蛋白质组学动态分析多次顺铂处理后的差异表达基因和蛋白,采用GO对差异基因和蛋白进行分类,应用DAVID软件在线富集相关信号通路。将找出的共同差异基因／蛋白与癌症基因图谱(TGCA)所提供卵巢癌敏感和耐药患者的信息进行临床预后分析,QRT-PCR对显著差异的A2M、CRABP2、ITIH3、MYLK、 EFEMP1、LNPEP和CTTNBP2NL基因进行验证。将TGCA提供的卵巢癌患者基因表达谱数据分为A2M、ITIH3和CTTNBP2NL基因高和低表达两组,分别比较两组间的差异基因,进行信号通路富集。 结果MTT法和流式细胞术测得SKOV3/DDPⅡ耐药指数分别为2.8和3.8, SKOV3/DDP I耐药指数为2.2和3.4；29.7μ moL/L和39.6u moL/L DDP处理36h的SKOV3/DDP I和SKOV3/DDP Ⅱ凋亡率显著低于SKOV3-GFP (P1=0.024, P2=0.001); SKOV3/DDPⅡ和SKOV3/DDP Ⅰ细胞内DDP浓度始终显著低于SKOV3-GFP细胞。DDP作用于体内移植瘤5次后,大部份SKOV3-GFP细胞器降解,细胞核膜不完整,但SKOV3/DDPⅡ细胞在8次用药后才出现细胞器降解；体内SKOV3/DDPⅡ细胞的STAT5和BRCA1基因表达随用药次数递增而增大,XIAP和与DDP用药次数呈正相关(R=0.964)。DDP作用体内移植瘤8次后,STAT5, XIAP和BRCA1在SKOV3/DDPⅡ的相对表达分别显著高于对应处理的SKOV3-GFP细胞3.86倍,28.1倍和14.6倍,PTEN则降低3.77倍。利用表达谱芯片找出535个差异表达的基因,其中有239个上调表达,296个下调表达,定量蛋白质组学共找出上调差异蛋白的573个,下调458个。通过DAVID软件的GO模块对基因进行功能注释并对基因进行功能聚类分析,发现这些差异表达的基因主要参与胞内受体介导的信号、免疫应答、激素应激反应、细胞周期、转录及拼接、信号转导、细胞增殖和凋亡等生物学过程。用DAVID软件的KEGG Table and Map功能模块进行分析发现,表达谱芯片和质谱上调的差异基因主要参与DNA的复制、非同源末端修复、氧化磷酸化和氨基酸、核苷酸的代谢和Ⅱ型糖尿病形成,下调基因主要参与肌动蛋白细胞骨架调节、补体系统、抗原加工与提呈、氨基酸代谢和Nod样受体信号通路等。ITIH3、MYLK、A2M、CRABP2、EFEMP、LNPEP和CTTNBP2NL基因的QRT-PCR验证结果与筛选结果一致。分析TCGA提供的卵巢癌患者临床信息发现,A2M在耐药患者中表达显著降低,CTTNBP2NL与患者无进展生存时间和无铂类治疗间隔负相关,高和低表达A2M与LNPEP基因两组患者的生存曲线存在明显差异。A2M基因组的上调基因主要参与免疫应答相关信号通路,包括NK细胞介导的细胞毒性通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路,TOLL样受体信号通路,NOD样受体信号通路以及肿瘤形成通路等,而下调基因主要参与各种代谢及错配修复等通路；LNPEP基因组上调基因主要参与细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子、肿瘤形成、凋亡信号转导、Wnt信号、P53信号、Fc受体介导的吞噬、泛素介导的蛋白降解、TOll样受体等信号通路,而下调基因主要参与钙信号转导通路、肿瘤形成、平滑肌收缩、GnRH通路和视黄醇代谢等信号转导通路；CTTNBP2NL基因组中上调基因参的信号通路主要有细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子、肿瘤形成、凋亡信号转导、NK细胞介导的细胞毒性、泛素介导的蛋白降解、TGF-β信号、Wnt信号、P53信号、Toll样受体和NOD样受体等信号转导通路,而下调表达基因参与的钙信号转导通路、平滑肌收缩、细胞内吞、GnRH通路等信号转导通路。 结论建立卵巢癌铂类耐药体内模型,所获耐药细胞SKOV3/DDPⅡ具有稳定的耐DDP指数。卵巢癌对铂类的获得性耐药是一个多步骤进行、多基因参与、多条信号通路同时进行调控的复杂的生物学过程。找出耐药细胞中下调的A2M、CRABP2、ITIH3和MYLK基因,以及上调的EFEMP1、 LNPEP和CTTNBP2NL基因,可能是通过对多条通路进行调控的关键分子,这给卵巢癌临床耐药逆转治疗提供了一个很好的理论基础。
【关键词】：卵巢上皮癌 铂类耐药 动物模型 表达谱芯片 定量蛋白质组学 TGCA
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R737.31
【目录】：

• 主要英文~.写5-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-16
• 第一章 卵巢癌铂类耐药研究进展(文献综述)16-37
• 1、卵巢癌化疗现状16-21
• 2、铂类药物抗肿瘤机理21-25
• 3、已知的铂类耐药机制25-34
• 4、铂类耐药研究的困难及问题34-35
• 5、本文研究的目的和意义35-37
• 第二章 卵巢癌顺铂耐药裸鼠模型的构建37-102
• 1 材料与方法37-58
• 1.1 细胞和动物来源37-38
• 1.2 试剂和仪器38-39
• 1.3 细胞培养39-41
• 1.4 诱导耐药方法41-43
• 1.5 体内肿瘤生长检测43-44
• 1.6 IC50、耐药指数测定44-46
• 1.7 流式细胞仪对不同浓度的DDP作用后细胞凋亡的检测46-47
• 1.8 流式细胞仪检测细胞周期47-49
• 1.9 高效液相色谱(HPLC)检测细胞内顺铂49-51
• 1.10 透射电子显微镜观察细胞超微结构51-52
• 1.11 实时劳光定量PCR (QRT-PCR)检测裸鼠模型瘤块中耐药相关基因的表达52-58
• 2 结果58-96
• 2.1 卵巢癌铂类耐药裸鼠模型成功建立58-63
• 2.2 细胞的耐药指数测定63
• 2.3 细胞凋亡分析63-68
• 2.4 半抑制浓度DDP作用后细胞周期变化分析68-73
• 2.5 细胞周期变化与凋亡的相关性分析73-75
• 2.6 高效液相色谱检测体外培养细胞内DDP浓度的结果75-85
• 2.7 电镜观察不同DDP注射次数细胞超微结构的变化85-89
• 2.8 QRT-PCR验证裸鼠模型耐药相关基因的表达89-96
• 3 讨论96-102
• 第三章 表达谱芯片和定量蛋白质组技术动态分析卵巢癌抵抗顺铂相关分子102-164
• 1 材料与方法103-120
• 1.1 肿瘤组织来源104
• 1.2 仪器和试剂104-106
• 1.3 基因芯片实验流程106-113
• 1.4 表达谱芯片数据分析流程113-114
• 1.5 定量蛋白组试验操作步骤114-116
• 1.6 数据处理方法116-117
• 1.7 TCGA数据来源117
• 1.8 表达谱芯片和质谱找出的共同差异的基因/蛋白与TCGA数据进行临床预后分析117-118
• 1.9 QRT-PCR对筛选出来的差异基因进行验证118-120
• 1.10 差异表达基因所调控的信号通路120
• 2 结果120-157
• 2.1 mRNA表达谱的结果121-123
• 2.2 质谱结果分析123
• 2.3 mRNA芯片结果关联质谱结果分析耐药相关差异蛋白123-132
• 2.4 耐药相关信号通路的生物信息学分析132-138
• 2.5 顺铂耐药差异蛋白与临床预后分析138-142
• 2.6 筛选出的基因进行荧光定量PCR(QRT-PCR)验证142-146
• 2.7 分析筛选出的差异表达基因所调控的信号通路146-157
• 3 讨论157-164
• 第四章 全文小结164-167
• 1 技术路线总结164-166
• 2 结果总结166-167
• 参考文献167-184
• 致谢184-185

【参考文献】

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本文编号：828502