弓形虫P30蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其诱导小鼠免疫应答的研究

发布时间：2017-09-12 09:26

  本文关键词：弓形虫P30蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其诱导小鼠免疫应答的研究

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【摘要】：目的构建弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达质粒L2Ps-P30-T，并在乳酸乳球菌中表达P30基因，然后用表达弓形虫P30蛋白的乳酸乳球菌口服免疫小鼠，观察表达弓形虫P30蛋白的乳酸乳球菌所诱导小鼠的体液免疫、黏膜免疫水平及对弓形虫感染的保护力。 方法以BamHI及XhoI限制性内切酶将P30从构建好的质粒pSK-P30中切出并克隆至构建好的质粒pSK-PsT，构建成pSK-Ps-P30-T质粒，用PvuII限制性内切酶将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P30-T质粒中切出，用相同的酶切位点导入大肠杆菌和乳球菌穿梭质粒pTRKL2，构建成L2Ps-P30-T质粒，通过电转化技术将L2Ps-P30-T导入至乳酸乳球菌，用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定P30在乳酸乳球菌中的表达。选用69只体重为（18±2）g健康雌性BALB/c小鼠，将小鼠随机分组为疫苗免疫组、乳球菌对照组和生理盐水组，每次每只小鼠分别饲喂5×109个的表达弓形虫P30蛋白的乳酸乳球菌悬液、不含重组质粒的乳酸乳球菌悬液和等体积的生理盐水。分别在喂食小鼠后第27、34及48天从小鼠尾静脉采血、分离血清，用ELISA（酶联免疫吸附试验）检测小鼠血清中IgG水平；在喂食小鼠后第48天每组杀死3只小鼠，分离小鼠的小肠黏液及脾细胞，检测小肠黏液中的SIgA水平；培养脾细胞，检测培养上清中INF-γ、IL-4和IL-10水平。同时第48天用弓形虫灌胃感染每组剩下的其他小鼠（每组20只），感染后记录小鼠的发病情况，计算小鼠死亡率，小鼠灌胃感染30d后解剖小鼠并统计小鼠肝、脑组织中的虫体数量，统计学分析结果。 结果用酶切及PCR方法鉴定质粒L2pS-P30-T构建正确。SDS-PAGE电泳没有检测到P30蛋白的表达。但Western blotting检测到乳球菌中表达能被弓形虫病人血清识别的约30kDa蛋白。小鼠血清中抗P30IgG水平随时间增高，小鼠血清中IgG水平疫苗免疫组与乳球菌对照组、生理盐水组比较，其存在的差异均有统计学意义（P 0.01）。乳球菌对照组与生理盐水组比较其差异没有统计学意义（P0.05）；小鼠小肠黏液中的SIgA水平疫苗免疫组与乳球菌对照组、生理盐水组比较，，其存在的差异均有统计学意义（P0.01）。乳球菌对照组与生理盐水组比较其差异没有统计学意义（P0.05）；弓形虫灌胃感染后的小鼠肝、脑组织中虫体数疫苗免疫组与乳球菌对照组、生理盐水组比较，其存在的差异有统计学意义（P0.05）。乳球菌对照组、生理盐水组比较，其存在的差异无统计学意义 结论 1弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体质粒L2pS-P30-T构建正确。 2P30在乳酸乳球菌中得到了表达，但表达量低。 3表达弓形虫P30蛋白的乳酸乳球菌可诱导小鼠的黏膜免疫和体液免疫，对弓形虫感染能产生一定的保护力。
【关键词】：弓形虫 P30 乳酸乳球菌 表达 口服疫苗
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5;R392
【目录】：

• 主要缩略语英文索引4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 一 实验材料14-17
• 1.材料14-15
• 2.仪器设备15-17
• 二 实验技术路线图17-18
• 三 实验方法18-25
• 1.pSKPs-T，pSKP30 及 pTRKL2 质粒 DNA 的小量制备18-19
• 2. BamHI/XhoI 分别双酶切 pSKPs-T/pSKP30 质粒及目的片断的回收19
• 3. pSKPs-T 酶切产物与 P30 的连接反应19
• 4.感受态细菌的制备19-20
• 5. 连接产物转化和蓝白斑筛选20
• 6. pSKPs P30-T 重组质粒的 PCR 鉴定20-21
• 8.pSKPs P30-T 重组质粒的双酶切鉴定21
• 9. PvuII 酶切 pSKPs P30-T/质粒及大肠杆菌与乳球菌穿梭质粒pTRKL2 及回收目的片段21
• 10. -Ps-P30-T-与 pTRKL2 的 PvuII 酶切产物的连接反应21
• 11. 感受态制备，连接产物转化，蓝白斑筛选和重组质粒抽提鉴定21
• 12. DNA 序列测定21
• 13. 乳球菌电转化21-22
• 14. 挑取克隆抽提质粒，PCR 及双酶切鉴定22
• 15. P30 基因在乳球菌中的表达22
• 16. Western blotting 检测 P30 的表达22-23
• 17. 小鼠口服免疫方法23
• 18. 小鼠血清 IgG 检测23
• 19. 小鼠小肠液 SIgA 的检测23
• 20. 小鼠脾细胞获取及培养23-24
• 21. 保护性实验24
• 22.统计学分析方法24-25
• 四 结果25-34
• 五 讨论34-37
• 六 结论37-38
• 参考文献38-41
• 附录41-47
• 文献综述47-52
• 参考文献49-52
• 在读期间科研成果52-54
• 致谢54

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本文编号：836393