肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠“脑肠轴异常”调控作用的分子机制及相关差异蛋白的分析

发布时间：2017-09-13 02:49

  本文关键词：肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠“脑肠轴异常”调控作用的分子机制及相关差异蛋白的分析

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【摘要】：目的： 探讨肠激安胶囊对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)模型大鼠血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)含量的影响；探讨肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织NPY mRNA的表达和CGRP mRNA表达的影响；建立IBS-D模型组和对照组结肠组织蛋白质双向电泳图谱,结合质谱技术鉴定并分析差异表达蛋白,对候选表达差异蛋白进行蛋白质功能和相关研究,进一步阐明IBS-D脑肠轴异常机制。 方法： (1)将SD大鼠随机分为正常组,模型组,匹维溴铵组(0.018g/kg),肠激安胶囊高(2.812g/kg)、中(1.406g/kg)、低(0.703g/kg)剂量组,每组8只,模型组以及给药组采用母乳分离+醋酸刺激+四肢束缚法制备IBS-D大鼠模型,各组按20mL/kg灌胃给药,正常组和模型组给予等剂量的生理盐水,连续给药14天,采用ELISA法检测各组大鼠血清中ACTH和CORT的含量。 (2)采用实时荧光定量PCR检测大鼠下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP mRNA的表达：取冻存组织,加液氮研磨后按每100mg组织加入1mL Trizol试剂,总RNA的提取按TRIzol试剂说明书进行,用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和含量。引物序列如下：NPY：上游5'-TTCAGCCACCCGAGAT-3',下游5'-GCTTATGACCCGCACTTA-3'; CGRP:上游5'-ATCCATAACATGACAGCATGG-3',下游5'-CAGTTCTTTAAGCATTGGTTCCA-3';内参18S：上游5'-CGACACTACATCAATC-3',下游5'-ATACAACGACAACAAG-3'.荧光定量PCR总反应体积25μL,反应体系为：12.5μL SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix,前后引物各1μL,1μL cDNA,9.5μL ddH20。反应条件：94℃5min；94℃30s,55℃40s,72℃50s,共35个循环；最后72℃7min结束反应,运用2-△△Ct法计算各组下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP基因的相对表达量。 (3)采用双向凝胶电泳法分离IBS-D模型组和正常对照组结肠差异蛋白,运用MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行鉴定,运用Gene Ontology和Pathway Studio生物信息学方法将所鉴定的差异蛋白进行功能分类,分析IBS-D病理机制中关键蛋白和涉及到的相关通路。 结果： (1)与正常对照组比较,IBS-D大鼠血清中ACTH含量明显升高(P＜0.01),肠激安胶囊高、中剂量组均显著降低大鼠血清中ACTH含量(P＜0.01)；与正常对照组比较,IBS-D大鼠血清中CORT含量明显升高(P＜0.01),肠激安胶囊高、中剂量组均明显降低大鼠血清中CORT含量(P＜0.05)；肠激安胶囊治疗IBS-D的机制可能与下调HPA轴中ACTH和CORT含量有关。 (2)通过荧光定量PCR研究肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA和CGRP mRNA表达的影响,结果表明,与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA表达明显降低,肠激安胶囊高、中、低剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠下丘脑NPY mRNA的表达,肠激安胶囊高、中剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠结肠NPY mRNA的表达；与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中CGRP mRNA表达明显增加,肠激安胶囊高、中剂量组均能明显降低IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织CGRP mRNA的表达。 (3)本研究首次运用蛋白组学的方法寻找IBS-D模型组和正常对照组结肠的差异表达蛋白特征谱,结果发现差异倍数在2.5倍以上的差异蛋白有15个：氯离子通道蛋白1(Chloride intracelluLar channel protein1, CLIC1);硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX);热休克蛋白(10kDa heat shock protein, HSP10);细胞角蛋白8(Cytokeratin-8, CK8)前梯度同源蛋白2(anterior gradient homolog2, AGR2);肌动蛋白辅助蛋白类似蛋白(Coactosin-like protein, COTL1);淋巴细胞胞浆蛋白1(lymphocyte cytosolic protein1, LCP1);蛋白质磷酸酶2调节亚基1A(protein phosphatase2, reguLatory subunit A, PPP2R1A);烯醇化酶3(Enolase3);泛醇细胞色素C还原酶核心蛋白I(Ubiquinolcytochrome c reductase core protein I, UQCRC1);泛醌NADH脱氢酶Fe-S蛋白1(NADH dehydrogenase Fe-S protein1, NDUFS1);细胞色素C氧化酶亚基5B(Cytochrome coxidase subunit5B, COX5B);二磷酸3核苷酸酶1(3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase1, BPNT1)。结论： 肠激安胶囊高中剂量组治疗IBS-D的机制可能与下调IBS-D脑肠轴异常的机制中HPA轴ACTH和CORT的含量有关；肠激安胶囊对IBS-D大鼠脑肠轴异常机制有调节作用,其作用机制可能是通过上调下丘脑和结肠组织NPY mRNA表达和下调下丘脑和结肠组织CGRP mRNA表达有关；热休克蛋白、硫氧还蛋白、氯离子通道蛋白等可能是IBS-D脑肠轴异常机制中潜在分子标志物。
【关键词】：肠激安胶囊 腹泻性肠易激综合征 脑肠轴异常 蛋白组学 神经肽Y 降钙素基因相关肽 促肾上腺皮质激素 皮质酮 下丘脑 结肠
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 目录8-11
• 前言11-13
• 第一章 肠易激综合征“脑肠轴异常”机制及治疗的研究进展13-23
• 1 IBS“脑肠轴异常”机制13-15
• 1.1 五羟色胺及其受体14
• 1.2 神经肽Y14-15
• 1.3 降钙素基因相关肽15
• 1.4 HPA轴15
• 2 肠易激综合征的治疗15-22
• 2.1 肠易激综合征的中药治疗16
• 2.2. 肠易激综合征的西药治疗16-21
• 2.3 肠易激综合征的针灸治疗21
• 2.4 肠易激综合征的心理治疗21-22
• 2.5 肠易激综合征的饮食治疗22
• 3 总结22-23
• 第二章 肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠血清中ACTH和CORT含量的影响23-30
• 1 引言23
• 2 材料与方法23-26
• 2.1 实验动物23
• 2.2 实验药品23
• 2.3 造模方法与动物分组23-24
• 2.4 模型的评估24
• 2.5 模型组和正常组大鼠下丘脑、结肠组织HE染色24
• 2.6 肠激安胶囊对IBS-D大鼠血清中ACTH含量的影响24-25
• 2.7 肠激安胶囊对IBS-D大鼠血清中CORT含量的影响25-26
• 2.8 统计学处理26
• 3 研究结果26-28
• 3.1 模型验证结果26
• 3.2 IBS-D模型组和正常对照组下丘脑和结肠组织HE染色结果26-27
• 3.3 肠激安胶囊对IBS-D大鼠血清中ACTH含量的影响27-28
• 3.4 肠激安胶囊对IBS-D大鼠血清中CORT含量的影响28
• 4 讨论28-30
• 第三章 肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织NPY mRNA和CGRPmRNA表达的影响30-44
• 1 引言30
• 2 材料与方法30-34
• 2.1 实验药品与试剂30-31
• 2.2 主要仪器31
• 2.3 总RNA的提取31
• 2.4 RNA的逆转录合成cDNA31-32
• 2.5 Real-time PCR的扩增32-33
• 2.6 PCR产物的初步鉴定33
• 2.7 Real-time PCR反应33-34
• 2.8 统计学处理34
• 3 研究结果34-41
• 3.1 荧光定量PCR检测NPY mRNA的表达34-38
• 3.2 荧光定量PCR检测CGRP mRNA的表达38-41
• 4 讨论41-44
• 第四章 IBS-D大鼠模型组和正常组结肠组织2-DE图谱的建立及差异蛋白的鉴定44-62
• 1 引言44
• 2 材料与方法44-51
• 2.1 主要试剂44-45
• 2.2 实验仪器45
• 2.3 生物信息学软件45-46
• 2.4 主要溶液的配制46-47
• 2.5 实验方法47-48
• 2.6 2-DE步骤48-49
• 2.7 图像扫描与分析49
• 2.8 差异表达蛋白的酶解49-50
• 2.9 质谱鉴定50
• 2.10 差异表达蛋白的功能分类和蛋白质相互作用网络图50-51
• 3 研究结果51-60
• 3.1 Bradford法测定蛋白浓度51
• 3.2 IBS-D大鼠模型组和对照组结肠组织的2-DE结果51-53
• 3.3 差异蛋白的质谱鉴定53-54
• 3.4 差异蛋白的功能分类54-55
• 3.5 鉴定的差异蛋白的网络关系图55-60
• 4 讨论60-62
• 结语62-64
• 参考文献64-72
• 附录72-80
• 在学期间参与课题、发表论文与获奖情况80-81
• 致谢81

【参考文献】

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