基于胚胎干细胞定向诱导神经分化模型评价bFGF对神经发育作用的影响

发布时间：2017-09-13 15:32

  本文关键词：基于胚胎干细胞定向诱导神经分化模型评价bFGF对神经发育作用的影响

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【摘要】：目的: 建立小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞离体实验模型，探讨不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对小鼠神经发育过程的影响。 方法: (1)将ESC形成的EB使用5×10~(-7)mol/L维甲酸（ratinoic acid，RA）进行悬浮诱导2天，之后换用ITS培养基，诱导OG2小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向神经细胞定向分化，并通过形态学观察、免疫荧光和定量PCR等方法，用于ESC向神经细胞分化的鉴定；(2)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF和VPA15天后，用CCK8法检测测定物bFGF和阳性对照药物丙戊酸（valproic acid, VPA）的神经毒性作用；(3)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF15天后，Q-PCR定量分析法检测测定物bFGF和VPA对神经特异性标记基因表达的影响，并用蛋白印记方法验证Q-PCR结果的准确性和一致性；(4)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF15天后，流式细胞术和Hoechost染色等方法测定bFGF在非细胞毒性剂量下对神经分化细胞凋亡等影响。 结果: （1）成功建立胚胎干细胞定向分化为神经细胞的模型。形态学观察、免疫荧光和定量PCR等方法用于ESC向神经细胞分化的鉴定结果表明，所诱导分化形成的神经细胞具有神经细胞特征，可用于bFGF神经作用及其毒性的实验研究。 （2）验证神经细胞定向分化模型用于评价待测物神经发育毒性的有效性。用所建立神经细胞定向分化模型，检测已知胚胎毒性药物丙戊酸（VPA）对已分化神经细胞的毒性及ES细胞向神经细胞分化过程神经组织特异性基因的影响，以验证所建立的干细胞神经诱导分化模型的可用性。结果表明，VPA的IC_(50)=103μg/mL，对神经组织特异性基因影响的结果与文献研究结果类似，表明该诱导分化模型可用于神经发育毒性的检测。 （3）bFGF对小鼠胚胎干细胞神经发育过程的影响。用所建立的神经细胞分化模型，检测bFGF对神经发育过程的影响，结果表明，bFGF的IC_(50)=9.6μg/mL；0.1μg/mL bFGF可诱导神经元分化和成熟；1μg/mLbFGF主要促进神经前体细胞的生长，，提高mES-NPC的增殖能力；10μg/mL bFGF为促进神经元细胞的生长。在所试验浓度范围内，未见对神经分化细胞造成明显毒性表现。 （4）所用剂量bFGF未发现具有诱发神经细胞凋亡及氧化应激损伤毒性。 结论: 本研究建立小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞实验模型，探讨不同浓度的bFGF对小鼠神经发育过程的影响。研究结果表明，bFGF在0.1-10μg/mL范围内，主要表现为诱导神经元分化和成熟，增强mESC-NPC的增殖能力，以及促进神经元细胞的生长。未见到bFGF对神经细胞的明显毒性，表明bFGF在常用浓度条件和高剂量下使用相对安全。
【关键词】：碱性成纤维生长因子（bFGF） 小鼠胚胎干细胞（ESC） 丙戊酸（VPA） 神经发育 神经毒性
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 目录7-10
• 第一章 前言10-20
• 1. ESC 定向诱导神经细胞的方法10-13
• 1.1 拟胚体培养法(EB culture method)11-12
• 1.2 共培养法(coculture method)12
• 1.3 单层培养法(monoculture method)12-13
• 2. ESC 定向分化为神经细胞模型用于神经毒理的评价13-14
• 3. 神经特异性标记物的研究现状14-16
• 3.1 巢蛋白(Nestin)14
• 3.2 成对盒蛋白 6 (Paired box protein 6, Pax-6)14-15
• 3.3 微管相关蛋白(Microtubule-associated protein, MAP)15
• 3.4 微管蛋白(Tubulin)15
• 3.5 神经丝蛋白(Neurofilament protein, NF)15
• 3.6 胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)15-16
• 4. bFGF 的生物学活性16-17
• 4.1 bFGF 广泛的生物学活性16
• 4.2 bFGF 神经诱导作用的研究进展16-17
• 5. 研究目的及技术路线17-20
• 5.1 立体依据17-18
• 5.2 拟研究内容18-19
• 5.3 技术路线图19-20
• 第二章 材料与方法20-31
• 1. 实验仪器和材料20-25
• 1.1 实验动物20
• 1.2 细胞系20
• 1.3 实验仪器20-21
• 1.4 实验材料21-22
• 1.5 主要试验溶液的配制22-25
• 2. 实验方法25-31
• 2.1 小鼠胚胎干细胞培养、鉴定和分化25-26
• 2.2 细胞免疫荧光染色分析26-27
• 2.3 CCK8 测定 bFGF 和 VPA 的细胞毒性（IC50）27
• 2.4 神经细胞特异性基因表达分析27-29
• 2.5 细胞总蛋白的制备和免疫印迹29-30
• 2.6 碘化丙啶（propidium iodide）检测细胞凋亡30
• 2.7 Hoechst 33342 检测细胞凋亡30
• 2.8 细胞培养液中氧化应激蛋白的测定30
• 2.9 数据统计30-31
• 第三章 实验结果31-48
• 1 胚胎干细胞定向分化为神经细胞模型的建立31-38
• 1.1 ESC 未分化的鉴定31-32
• 1.2 神经诱导分化程序及结果32-33
• 1.3 RA 最佳诱导浓度的确定33-34
• 1.4 免疫荧光检测神经前体细胞特异性标记蛋白34-35
• 1.5 免疫荧光检测神经元细胞特异性标记蛋白35
• 1.6 RT-PCR 测定分化各个时期特异性标记基因35-36
• 1.7 Q-PCR 检测未分化特异性标记基因的表达36-38
• 2 不同浓度的 bFGF 对神经诱导过程的影响38-41
• 2.1 形态学观察不同浓度的 bFGF 对神经诱导过程的影响38-39
• 2.2 bFGF 对 ESC 来源神经细胞的毒性作用（IC50）39
• 2.3 bFGF 对 ESC 分化为神经细胞过程中冠状结构的影响39-40
• 2.4 验证神经细胞定向分化模型用于评价待测物神经发育毒性的有效性40-41
• 3 不同浓度 bFGF 对胚胎干细胞来源的神经细胞的特异性标记基因和蛋白的影响41-44
• 3.1 bFGF 对神经细胞特异性标记基因表达的影响41-44
• 3.2 bFGF 对神经细胞特异性标记蛋白表达的影响44
• 4 bFGF 对神经细胞分化过程中抑制凋亡和氧化应激作用44-48
• 4.1 bFGF 对神经细胞分化过程中细胞凋亡率的影响44-46
• 4.2 bFGF 对神经细胞分化过程中细胞凋亡的形态学观察46
• 4.3 不同浓度 bFGF 对神经分化细胞培养基中氧化应激水平的影响46-48
• 第四章 讨论48-53
• 4.1 胚胎干细胞定向分化神经细胞模型的建立及 bFGF 的作用48-49
• 4.2 VPA 用于验证神经诱导分化模型的有效性49
• 4.3 bFGF 胚胎干细胞来源神经细胞的扩增、分化的影响49-51
• 4.4 毒性相关神经特异性标记物的筛选51
• 4.5 bFGF 胚胎毒性与神经毒性作用的关系51-53
• 结论53-54
• 展望54-55
• 参考文献55-64
• 英文缩略词表64-65
• 攻硕期间发表论文65-66
• bFGF 原液检验报告单66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘晓阳,孙洪亮,汤继文;碱性成纤维细胞生长因子对培养的半月板纤维软骨细胞的促进增殖作用[J];中国临床康复;2004年02期

本文编号：844542