我国部分地区艰难梭菌PCR-核糖体分型及毒素基因多态性研究

发布时间：2017-09-14 14:25

  本文关键词：我国部分地区艰难梭菌PCR-核糖体分型及毒素基因多态性研究

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【摘要】：目的了解我国4个地区艰难梭菌PCR-核糖体型别的分型情况,并获得该4个地区艰难梭菌临床株A、B毒素基因序列,分析其基因多态性特征,了解不同型别菌株的tcdA、tcdB序列遗传特征,并探讨可能的进化特征。同时将A、B毒素基因多态性与PCR-核糖体分型结合分析,寻找合适位点,为深入开展流行病学调查、溯源、建立适用于我国的分子检测方法提供依据。方法选取4个地区的104株难梭菌临床分离株,分别为北京、广东、山东、河南,进行毒素基因分型、PCR-核糖体分型后,从genBank下载艰难梭菌630(A+B+菌株)和M68(A-B+菌株)的基因做为模板,对tcdA、tcdB进行引物设计、sanger测序基因全长。测序结果使用DNA序列拼装软件进行序列拼装,得到测序重叠群(contigs),再以艰难梭菌630和M68为模板,确定基因起始点和终止点。对获得的50株艰难梭菌的tcdA、tcdB序列,进行数据分析,包括：PCR-核糖体型别分类、序列碱基比对、统计碱基差异数、多态性分析(SNP)、进化分析、流行病与统计学分析。结果此次研究我们成功的获取了104株来自中国4个不同地区的临床艰难梭菌的PCR-核糖体型别,共分20个型别。我国菌株基因遗传特征与欧美不同,研究中收集到部分地区的菌株显示以RT017为优势菌株(21.15%),其次为RT046/043(15.53%),RT001(14.56%)。同时还获得了不同型别代表菌株tcdA和tcdB序列,共50个tcdA、50个tcdB序列。分析结果发现,A、B基因多态性明显。tcdA序列的非同义突变SNP和碱基缺失主要发生在受体结合区,提示该区经历过激烈的正进化选择压力。tcdB序列没有发现大片段碱基缺失的现象,但是其SNP明显高于tcdA,且菌株间的突变率也要大于tcdA,进化速率更快,其非同义突变SNP集中于glucosyltransferase domain和auto-protease domain。这种现象提示,毒素基因或整个PaLoc区存在基因重组或HGT,有利于进化中的菌株保存其优势基因序列。经过分析,PCR-核糖体型别与毒素基因序列间存在着一定的联系,如如12株RT001的序列组合均为A05804,11株RT017中9株为A11807,9株RT046/043中7株为A02802,3株RT012均为A08801。结论我国部分地区艰难梭菌临床菌株的PCR-核糖体型以RT017为主(21.15%),其次为RT046/043(15.53%),RT001(14.56%),且型别存在一定的地域性分布,北京、广东以RT017为流行株,河南以RT046/043为流行株,山东以RT001为流行株,这提示应针对不同的地区建立相应的检测方法。艰难梭菌毒素型以A+B+为主,且A、B基因变异度高,具有多态性；tcdA:SNP和大片段碱基序列缺失主要发生在3’端的受体结合区;tcdB:SNP高于tcdA,主要发生在葡糖基转移酶区。本研究对A、B基因序列组合与PCR-核糖体分型进行初步探讨分析,发现存在着一定相对应的关系,如如12株RT001的序列组合均为A05804,11株RT017中9株为A11807,9株RT046/043中7株为A02802,3株RT012均为A08801。提示可以建立一种既能反应毒素情况,又能显示菌株PCR-核糖体型别的分型方法,这对于我国快速检测和治疗艰难梭菌都有重要意义。
【关键词】：艰难梭菌 tcdA tcdB PCR-核糖体分型 毒素基因序列
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 英文缩略语7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-26
• 1. 实验菌株来源15
• 2. 主要试剂和仪器15-16
• 3. 主要软件16
• 4. 艰难梭菌分离培养16
• 5. 艰难梭菌生化鉴定16-17
• 6. 提取测序菌株全基因组DNA及分子生物学鉴定17-19
• 7. 毒素基因的检测19-20
• 8. PCR-核糖体分型20
• 9. Sanger测序tcdA和tcdB20-23
• 10. 艰难梭菌tcdA和tcdB序列数据分析23
• 11. 用promage试剂盒提取艰难梭菌全基因组DNA23-26
• 实验结果26-35
• 1. 菌株来源及分型26-29
• 2. 菌株A、B毒素序列分析29-33
• 2.1 A毒素序列分析29-30
• 2.2 B毒素序列分析30-31
• 2.3 毒素序列进化分析31-32
• 2.4 部分菌株未测序成功原因分析32-33
• 3. PCR-核糖体型别与A、B毒素序列关系33-35
• 讨论35-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-54
• 参考文献50-54
• 附录54-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文61-62

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本文编号：850551