中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力研究

发布时间：2017-09-15 15:02

  本文关键词：中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力研究

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【摘要】：目的研究流行于我国西南地区（贵阳）猫源弓形虫株基因型分布及其毒力。探讨其与中国其他地区有无遗传差异，以及分离株对不同品系小鼠的毒力。 方法从中国西南地区（贵阳）收集猫的标本进行动物接种，分离虫株，收集小鼠腹水中的速殖子进行提取DNA，经PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP），，在SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1和Apico十个位点进行基因分型；反应总体积为50μl，其中PCR master mix25μl、上下游引物各1μl、DNA模板1.5μl。扩增条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min。反应结束后，每管取5μl PCR产物在含溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）的1%琼脂糖凝胶中100V电泳30min，并在凝胶成像仪中观察结果。然后各管余下PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物用相应的内切酶酶切。酶切后产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，0.5μg/ml溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统中观察电泳图谱，并与参考虫株图谱进行对比。经PBS稀释的纯化速殖子按1103个/只腹腔感染SPF级KM，BALB/c，C57BL，ICR小鼠，每组10只。逐日观察小鼠状态并计算死亡率和存活时间，进行毒力分析。 结果采用10个遗传位点，从贵阳分离出2株弓形虫株，经PCR-RFLP分析揭示了1个基因型（ToxoDB#9, China1）。基因型China1型在SAG2、GRA6、L358、PKl、c22-8位点为基因II型；在SAG3、BTUB、c29-2位点为基因III型；在Apico位点为基因I型。BALB/c、C57BL、KM、ICR四个品系雌鼠各10只，经腹腔接种1×103个CT-1虫株速殖子。C57BL小鼠感染后第5天开始出现竖毛、腹水、抽搐等明显症状甚至死亡，第6天完全死亡。BALB/c小鼠在第5、6、7这三天之内全部死亡。KM小鼠感染后6-7天，活动减少，出现弓背、竖毛等症状，第10天死亡2只小鼠，感染后第15天至观察45天结束，小鼠恢复正常活动，一直存活。ICR小鼠相对于BALB/c、C57BL小鼠症状轻微，在第10、14天分别死亡了2只和1只小鼠，其余的在45天内存活。存活的感染小鼠45天后颈椎脱臼处死，脑组织压片发现有大量包囊形成。通过进行不同品系小鼠毒力研究显示：CT-1虫株感染C57BL、BALB/c、KM、ICR小鼠死亡率有显著差异（P＜0.01），C57BL、BALB/c小鼠两者之间及KM、ICR小鼠两者之间对虫株无显著差异（P＞0.01）。 结论虽然从世界各地人体和动物体内分离得到的虫株的基因分型结果显示，各地刚地弓形虫具有丰富的遗传多态性。然而中国大陆虫株的基因分型结果与欧洲、非洲和北美的3个优势克隆株系截然不同：流行中国的动物源性弓形虫分离株具有有限的遗传多样性，弓形虫China1为其优势基因型；在生物多样性较为丰富的我国西南地区（贵阳），China1型（ToxoDB#9）为其优势基因型，流行我国的弓形虫分离株具有有限的遗传多态性；该型CT-1虫株对不同品系小鼠的致死力具有显著性差异。
【关键词】：弓形虫 基因分型 PCR-限制性片段长度多态性分析 毒力
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 英文缩略词汇表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-12
• 2 材料与方法12-27
• 2.1 实验材料12-16
• 2.1.1 组织样本12
• 2.1.2 实验动物及标准虫株12-13
• 2.1.3 PCR 引物及内切酶13
• 2.1.4 引物的稀释与储存13-14
• 2.1.5 部分试剂14
• 2.1.6 部分试剂的配制14-15
• 2.1.7 实验所用仪器与设备15-16
• 2.2 实验方法16-27
• 2.2.1 猫源性弓形虫的分离16
• 2.2.2 腹水基因组 DNA 提取16-17
• 2.2.3 目的基因扩增17-23
• 2.2.4 1%琼脂糖凝胶23
• 2.2.5 PCR 产物的酶切23-26
• 2.2.6 2.5%琼脂糖凝胶26-27
• 2.2.7 酶切产物结果分析27
• 2.2.8 小鼠的毒力27
• 2.2.9 统计学方法27
• 3 结果27-29
• 3.1 弓形虫基因分型27-28
• 3.2 小鼠毒力28-29
• 4 讨论29-32
• 5 结论32-33
• 参考文献33-37
• 附一37-38
• 附二38-39
• 附三（综述）39-47
• 参考文献45-47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：857219