抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

发布时间：2017-09-17 02:06

  本文关键词：抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

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【摘要】：3-硝基酪氨酸（3NT）是蛋白质翻译后修饰中的一种硝基化修饰产物，非常稳定，常在病理状态下伴随活性氧和活性氮的增加而产生，与炎症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和癌症等至少50种疾病关系紧密，被公认是体内活性氮的重要生物标志物。目前，3NT的检测主要采用HPLC及GC-MS等方法，与传统检测方法相比免疫检测方法如ELISA、WB等具有检测速度快、特异性强、操作简单而且灵敏度高和可选择性等优点，近年来日益受到国内外广泛关注。 本研究的目的是制备抗3-硝基酪氨酸（3NT）单克隆抗体（McAb），为与3NT相关疾病的研究提供基础。通过戊二醛法合成3-硝基酪氨酸人工抗原：3硝基酪氨酸-戊二醛-鸡卵白蛋白（3NT-G-OVA）。经BCA测定其浓度，紫外扫描法，聚丙烯酰胺电泳法（SDS-PAGE）对人工抗原进行检测。将其作为免疫原，皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠，按常规方法融合并经间接ELISA法筛选，制备稳定分泌抗3NT单克隆抗体的克隆细胞株，扩大培养，，并对McAb的亚类、效价、亲和力及识别抗原特异性进行鉴定与分析，获得抗3NT单克隆抗体。收集糖尿病、类风湿性关节炎、肝硬化病人血标本，将抗3NT单克隆抗体初步应用于Western blotting检测样本的硝基化水平。同时用生物素标记制备的抗3NT单抗，作为包被于酶标板的第一抗体，过氧化物酶(POD)标记抗CTX-II多肽抗体作为第二抗体（POD-58-3），初步建立双抗体夹心ELISA法并进行了临床应用检测RA病人血清样本。 1.成功合成了人工抗原3NT-G-OVA，测得其偶联率为5.4。 2.成功获得了1株稳定分泌抗3NT单抗的杂交瘤细胞株，命名为2F6，单抗亚类试剂盒测定2F6的重链为IgG2a亚类；间接ELISA测定其腹水效价为1:6.14×10~6；单抗亲和力常数为7.81×10~7(M-1)；竞争ELISA鉴定2F6可特异性识别3NT。 3.制备了一株具有较高免疫活性和特异性的抗3NT单克隆抗体，并成功用于糖尿病、骨关节炎以及肝硬化病人的硝基化蛋白水平的Western Blotting检测。 4.夹心ELISA法检测RA病人血清样本测得的OD值比正常人高。成功的将抗3NT抗体临床应用，初步建立了夹心ELISA法，检测RA病人血清样本。 5.提高了58-3抗体特异性识别CTX-II的灵敏度，为软骨降解产物CTX-II提供了一种新的检测方法。
【关键词】：戊二醛法 3-硝基酪氨酸 单克隆抗体 鉴定 应用
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-11
• 第一章 引言11-17
• 1.1 蛋白硝基化概述11-13
• 1.2 蛋白硝基化与疾病的关系13-16
• 1.2.1 3NT 与糖尿病13-14
• 1.2.2 3NT 与动脉粥样硬化14
• 1.2.3 3NT 与神经退行性疾病14
• 1.2.4 3NT 与高血压14-15
• 1.2.5 3NT 与感染性休克15
• 1.2.6 3NT 与其它疾病15-16
• 1.3 3NT的检测现状与本课题的研究目的16-17
• 第二章 免疫原的合成与鉴定17-28
• 2.1 材料与方法17-21
• 2.1.1 实验材料17-19
• 2.1.2 实验方法19-21
• 2.2 结果与分析21-25
• 2.2.1 颜色判定21
• 2.2.2 紫外光谱法鉴定人工抗原21
• 2.2.3 SDS-PAGE 电泳21-22
• 2.2.4 卵白蛋白含量与偶联率测定22-23
• 2.2.5 抗血清效价测定与竞争抑制23-25
• 2.3 讨论25-27
• 2.4 小结27-28
• 第三章 单克隆抗体的制备与鉴定定28-50
• 3.1 材料与方法28-37
• 3.1.1 实验材料28-31
• 3.1.2 实验方法31-37
• 3.2 结果37-46
• 3.2.1 小鼠免疫结果37
• 3.2.2 杂交瘤细胞株的建立及筛选37
• 3.2.3 腹水的制备与纯化37-39
• 3.2.4 单克隆抗体类、亚类的测定39-40
• 3.2.5 单克隆抗体特异性40-43
• 3.2.6 单克隆抗体效价43-44
• 3.2.7 单克隆抗体亲和力常数测定44-46
• 3.3 结论46-49
• 3.4 小结49-50
• 第四章 单抗的初步应用-Western blot 检测50-58
• 4.1 材料与方法50-53
• 4.1.1 实验材料50-51
• 4.1.2 实验方法51-53
• 4.2 结果与分析53-56
• 4.2.1 POD-Ab 浓度测定53
• 4.2.2 POD-Ab ELISA 鉴定53-54
• 4.2.3 最佳抗原和抗体的浓度确定54
• 4.2.4 POD-Ab 应用于 Western blot54-56
• 4.3 讨论56-57
• 4.4 小结57-58
• 第五章 单抗的初步应用-夹心 ELISA 法的建立58-66
• 5.1 材料与方法58-61
• 5.1.1 实验材料58-59
• 5.1.2 实验方法59-61
• 5.2 结果与分析61-64
• 5.2.1 生物素标记抗体（Bio-2F6）浓度的测定61
• 5.2.2 包被抗体（Bio-2F6）与酶标二抗（POD-58-3）最佳工作浓度的确定61-62
• 5.2.3 夹心 ELISA 法的初步建立62-64
• 5.3 讨论64-65
• 5.4 小结65-66
• 第六章 全文总结66-69
• 致谢69-70
• 参考文献70-74
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果74

【参考文献】

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本文编号：866610