拮抗抗病毒因子A3G的HIV-1 Vif E3复合体对RBX的选择性研究

发布时间：2017-09-19 09:20

  本文关键词：拮抗抗病毒因子A3G的HIV-1 Vif E3复合体对RBX的选择性研究

  更多相关文章： HIV-1 RBX1/RBX2蛋白 Cullin-Ring泛素连接酶 Vif A3G

【摘要】：HIV-1Vif是分子大小为23KD病毒辅助蛋白，它对于在细胞内以特定方式产生有感染性的病毒是十分必要的。vif缺失使得病毒在感染非允许细胞时其复制受到了严重抑制。研究发现将允许细胞与非允许细胞融合的异核体显示了非允许细胞的特性，说明在非允许细胞内存在某种抑制因子，在后续研究中证实这种限制因子为CEM15，现在普遍称为A3G。A3G是广泛存在于非允许细胞内的一类胞苷脱氨酶，这种活性在病毒基因逆转录时会使病毒负义链DNA上出现C到U的基因组高突变，同时A3G也可以阻止病毒逆转录和DNA的整合。 在非允许细胞内Vif可以拮抗A3G的抗病毒作用，其机制主要是通过形成以Vif作为接头蛋白包括CBFβ，Cullin5，ElonginC、ElonginB、RBX蛋白在内的六连体E3连接酶复合体，之后经过E3级联反应将A3G泛素化再通过细胞内蛋白酶体途径将其降解。作为接头蛋白，Vif用于募集E3复合物的功能位点已经被研究的比较透彻，E3各组分与Vif相互作用位点包括：Vif氨基端与CBFβ结合、Vif羧基端的SOCS基序的SLQ保守位点与ElonginC结合、Vif SOCS基序下游保守的HCCH基序与Cullin5结合。其中Cullin5蛋白作为骨架蛋白、EB-EC作为调节亚基、CBFβ作为Vif蛋白折叠的辅因子共同形成具有活性的E3连接酶复合体。在人体中RBX蛋白主要以两种亚型存在：RBX1和RBX2，作为Vif降解A3G的CRL复合体中与E2结合酶相互作用的Ring-蛋白的选择性还有待明确。 本论文针对HIV-1Vif降解抗病毒因子A3G的CRL接酶复合体中对RBX的选择性进行研究。首先通过免疫共沉淀，关键基序突变的方法探究了两种亚型RBX与骨架蛋白Cullin5之间的相互作用；通过RNA沉默、关键基序突变的生物学手段分别在细胞体系和病毒体系评价了两种RBX蛋白对于A3G降解机制的影响；此外又通过蛋白共折叠可溶性分析，多顺反子载体上的蛋白共纯化、体外构建泛素化体系等多种生物学手段分析了不同RBX蛋白形成的E3复合体对A3G泛素化程度的影响。 在研究不同RBX与骨架蛋白Cullin5之间的相互作用方面，，我们发现不论是带有标签或者不带有标签的两种RBX蛋白均能够与Cullin5相互作用；反向的免疫共沉淀结果与上面结果一致，不论是带有标签或者不带有标签的Cullin5蛋白均与两种RBX蛋白具有相互作用，并且两种RBX蛋白与Cullin5的相互作用具有相互竞争抑制性。 在探究不同RBX蛋白对于A3G降解机制的结论中，我们发现不论在细胞体系还是病毒体系两种RBX蛋白都能够参与A3G的降解。并且相对比而言RBX2对于A3G的降解影响更明显。 在含有不同RBX蛋白形成的E3复合体对A3G体外泛素化分析部分结果显示两种RBX蛋白形成的E3复合物均能在体外对A3G进行泛素化标记。 因而我们得到结论：在人体中的两种亚型的RBX蛋白均与CRL-Vif-CBFβ连接酶复合体中的骨架蛋白具有特异的相互作用，并且含有不同RBX的E3复合物均能够在体外对A3G进行泛素化标记，两种RBX蛋白均对HIV-1Vif所介导的A3G降解具有一定的影响。 通过本论文对HIV-1Vif介导的A3G降解过程的E3复合物对Ring蛋白选择性的研究结果延伸了我们对E3复合物功能机制的理解，为HIV的药物治疗提供了新的靶位点和可能性。
【关键词】：HIV-1 RBX1/RBX2蛋白 Cullin-Ring泛素连接酶 Vif A3G
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-12
• 第1章 前言12-24
• 1.1 HIV-1 与限制因子 A3G 研究概述12-22
• 1.1.1 HIV-1 简介12
• 1.1.2 限制因子及病毒辅助蛋白12-14
• 1.1.3 辅助蛋白 Vif 的功能研究14-15
• 1.1.4 抗病毒因子 A3G 的研究15-16
• 1.1.5 Vif 降解 A3G 的机制研究16-17
• 1.1.6 RING E3 连接酶的研究17-20
• 1.1.7 Cullin-RING 连接酶（CRLs）的研究20-22
• 1.2 本课题的研究目的与实验设计22-24
• 1.2.1 研究目的22-23
• 1.2.2 实验设计23-24
• 第2章 材料与方法24-36
• 2.1 材料、试剂及仪器24-29
• 2.1.1 质粒、菌种、细胞、抗体24-26
• 2.1.2 主要试剂配制26-28
• 2.1.3 主要仪器与设备28-29
• 2.2 实验方法29-36
• 2.2.1 真核体系质粒构建29-30
• 2.2.2 原核体系质粒构建30-32
• 2.2.3 蛋白表达32
• 2.2.4 Ni 柱亲和纯化32
• 2.2.5 细胞培养及转染32-33
• 2.2.6 RNA 干扰方法-siRNA33
• 2.2.7 稳定转染 shRBX2 细胞系的建立33-34
• 2.2.8 Western Blot 检测方法34
• 2.2.9 免疫共沉淀分析技术34-35
• 2.2.10 Nedd8 结合分析35
• 2.2.11 体外泛素化检测35-36
• 第3章 结果与分析36-66
• 3.1 CRL 的骨架蛋白 Cul5 与 RBX 蛋白的相互作用36-43
• 3.1.1 质粒 VR1012-Cul5、VR1012-RBX1、VR1012-RBX2 构建表达36-38
• 3.1.2 Cullin5 与 RBX 蛋白的相互作用分析38-43
• 3.2 不同 RBX 组成的 E3 复合物对 A3G 降解机制的影响43-52
• 3.2.1 细胞体系内对降解机制的影响43-50
• 3.2.2 病毒体系内对降解机制的影响50-52
• 3.3 含有不同 RBX 的 E3 复合体泛素化 A3G 的讨论52-66
• 3.3.1 质粒构建52-57
• 3.3.2 含有不同 RBX 的 E3 复合物的蛋白表达与纯化57-62
• 3.3.3 不同 E3 复合物对 Cul5 Nedd8 结合的分析62-64
• 3.3.4 不同 E3 复合物对 A3G 泛素化比较64-66
• 讨论66-68
• 结论68-69
• 参考文献69-76
• 致谢76-77
• 作者简介77

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王瑞红;史国利;程浩;范炜;路浩;;新型功能蛋白BST2研究进展[J];动物医学进展;2014年02期

2 尹鑫;魏萍;王晓钧;;天然免疫限制因子Tetherin的抗病毒机理研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2014年01期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 高国振;宿主因子Cyclin T1和Sam68在Ⅰ型人免疫缺陷型病毒生活周期中的功能研究[D];武汉大学;2012年

2 庞晓静;BRET方法研究BST-2和HIV-1 Vpu相互作用及小分子化合物抑制剂的筛选[D];北京协和医学院;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 吴星亮;干扰素应答分子Tetherin对抗马传染性贫血病毒的作用机制研究[D];中国农业科学院;2013年

2 朱迎紫;钙离子及水解酶在HIV-1 Vpu对宿主限制因子Tetherin拮抗过程中的作用研究[D];吉林大学;2014年

本文编号：880812