pIRES-Ag85A-ESAT6抗结核二价DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

发布时间：2017-09-19 17:30

  本文关键词：pIRES-Ag85A-ESAT6抗结核二价DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

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【摘要】：目的 通过以pIRES质粒为载体构建可同时独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原的抗结核二价DNA疫苗,并经体外实验评价其免疫原性及免疫效应,为新型结核疫苗的研发提供新的思路和实验基础。 方法 1.根据GenBank报道的目的基因(Ag85A和ESAT6基因)全长序列和pIRES质粒酶切位点的特点,利用DNAClub及Premier Primer5软件设计特异性引物。以结核杆菌标准株H37Rv的DNA为模版,经PCR扩增Ag85A和ESAT6基因,分别用限制性内切酶Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ、Eag Ⅰ对扩增产物和pIRES空质粒双酶切,经连接酶连接,构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,并经菌液PCR、质粒双酶切和质粒测序鉴定。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒鉴定构建成功后,转入DH5a菌株,筛选重组质粒,并用质粒小提试剂盒分离纯化质粒DNA。 3.将重组质粒采用脂质体法转染至RAW264.7细胞,于5%CO2培养箱中,37℃,培养24-48h后,western blot法检测质粒蛋白表达情况。 4.大量提取重组质粒,经三次肌肉注射质粒免疫BALB/c小鼠,每次间隔2w,末次免疫2w后,取小鼠血清,用ELISA法检测血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体情况。 5.同时无菌取小鼠脾细胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培养,用ELISA法检测培养液中细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)分泌情况。 结果 1.成功构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,经PCR鉴定、质粒双酶切,DNA凝胶电泳后,分别出现1017bp和288bp的条带,与Ag85A和ESAT6的理论值相符,并经测序进一步鉴定构建成功。 2.分别将用三种浓度的pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒转染至RAW264.7细胞后,经western blot鉴定证实了Ag85A和ESAT6两种蛋白可在细胞内成功表达,且表达水平与转染剂量存在正相关。 3. ELISA法检测免疫小鼠血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体变化情况,发现转染了pIRES-Ag85A-ESAT6质粒的二价疫苗组,相应的抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体明显升高,(P0.05),且IgG2a抗体升高明显。 4.在细胞因子检测中,pIRES-Ag85A-ESAT6质粒组的IFN-γ、IL-2水平显著升高(P0.05),而IL-4的值均较低,组间无显著差异性。 结论 1. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗,能够在真核细胞中独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗可诱导小鼠强烈的特异性免疫应答,且以Th1优势免疫应答为主。 3. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗较单一Ag85A或ESAT6疫苗特异性免疫应答强。
【关键词】：二价疫苗 Ag85A ESAT6 结核 免疫效应
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 插图或附表清单11-12
• 注释说明清单12-14
• 引言14-17
• 第一部分 独立表达Ag85A与ESAT6的抗结核二价DNA疫苗的构建17-35
• 1.1 材料17-20
• 1.2 方法20-28
• 1.3 结果28-33
• 1.4 讨论33-35
• 第二部分 Ag85A和ESAT6抗结核二价DNA疫苗免疫效应研究35-46
• 2.1 材料35-37
• 2.2 方法37-41
• 2.3 结果41-44
• 2.4 讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• 附录A pIRES质粒图谱52-53
• 附录B 重组质粒pIRES-Ag85A-ESAT6测序图53-55
• 致谢55-56
• 作者简介及读研期间主要科研成果56
• 在读期间参与撰写的文章56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：882988