人博卡病毒1-4型重组分析及人博卡病毒1型相关质粒的构建

发布时间：2017-09-20 05:34

  本文关键词：人博卡病毒1-4型重组分析及人博卡病毒1型相关质粒的构建

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【摘要】：目的1.人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)1-4型中仅HBoV1具有完整的基因组序列；且研究发现HBoV1-4之间可能存在基因重组。因此,获得HBoV1-4的全基因组或近似全基因组序列,对全面深入分析和研究HBoVs的基因特征及重组具有重要的科学意义。2.反向末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)对腺相关病毒的包装和感染力具有显著的影响,利用外源质粒提供Rep蛋白和Cap蛋白可以体外完成腺相关病毒或重组病毒的病毒包装和释放。因此,构建具有HBoV1 ITR的重组质粒和NS1、NP1、VP1/2的真核表达质粒对于HBoV1重组病毒相关研究具有重要的科学价值。对象和方法1.我国HBoV 1-4型的全基因组扩增及重组分析从南京和兰州地区腹泻患儿粪便标本中选择HBoV单阳性的标本,以GenBank来源的近似全基因组为参考株,用primer premier 5.0软件设计引物,采用普通PCR及接头法PCR扩增各基因片段,拼接后获得HBoV 1-4全基因组。对所获得的近似全基因组进行同源性比对及进化分析,利用RDP4软件分析HBoV 1-4间的基因重组关系。2.HBoV1型相关质粒的构建将从pEGFP-N1质粒上酶切下的EGFP荧光蛋白基因连接于酶切去除NS1、NP1和VP1/2的pIHBoV1质粒上,构建pITRGFP质粒；将HBoV1的编码区基因用PCR及酶切的方法最后连接在pcDNA3.1(+)上,构建pcRC质粒,将pITRGFP及pcRC共转染入HEK293细胞,SDS-PAGE鉴定上述载体构建成功与否。结果1.分别从南京和兰州地区的标本中扩增得到2条HBoV1、2条HBoV2、2条HBoV3、1条HBoV4近似全基因组序列,其中HBoV4为国内首次获得,HBoV2-NC为目前国内外最长全基因组序列；2.HBoV1和HBoV3在各编码区变异率较小,而HBoV2和HBoV4变异率较大,可能是潜在HBoV重组病毒株的来源；HBoV3可能由HBoV1和HBoV4重组进化而来,HBoV4可能由HBoV2与HBoV3重组进化而来。3.成功构建了HBoV1的相关载体pITRGFP和pcRC,上述载体在HEK293细胞中成功表达了GFP标签蛋白和HBoV1 VP2蛋白。结论1.扩增得到HBoV1-4的近似全基因组序列；2.HBoV1-4间存在着基因重组；3.成功构建了pITRGFP和pcRC质粒,对HBoV1的相关研究有着重要意义。
【关键词】：人博卡病毒1-4 基因重组 质粒构建
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 第一章 引言8-17
• 1.1 HBoV的分子生物学特征9-12
• 1.2 HBoV的致病机制12
• 1.3 HBoV与疾病相关性12-14
• 1.4 HBoV的诊断与治疗14
• 1.5 HBoV在基因治疗载体领域中的初步研究14-15
• 1.6 研究的目的和意义15-17
• 第二章 人博卡病毒1-4型重组分析17-54
• 2.1 实验材料17-18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.3 结果27-51
• 2.4 讨论51-54
• 第三章 人博卡病毒1型相关质粒的构建54-70
• 3.1 实验材料54-55
• 3.2 实验方法55-63
• 3.3 实验结果63-68
• 3.4 讨论68-70
• 结论70-71
• 全文创新点71-72
• 参考文献72-77
• 在学期间的研究成果77-78
• 致谢78-79
• 中英文对照表79

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本文编号：886223