重组人肠三叶因子对肠上皮细胞移行能力的影响及其机制研究

发布时间：2017-09-21 00:14

  本文关键词：重组人肠三叶因子对肠上皮细胞移行能力的影响及其机制研究

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【摘要】：目的：观察重组人肠三叶因子(recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)对肠上皮细胞移行能力的影响并探讨其作用机制。 方法： 1.实验用药：采用本实验室重组表达的人肠三叶因子(rhITF)作为细胞刺激药物，该重组蛋白纯度达到98%以上，符合临床前药物研究标准。 2.细胞模型：以传代培养的人结肠癌Caco-2细胞株为研究模型，购置于中科院细胞所，鉴定正确后进行传代培养，再将传至第5-10代的细胞用于实验。 3.实验分组：根据实验目的不同，本实验采用多个分组模式，涉及的实验组包括：(1)阴性对照组和不同浓度的rhITF组；(2)正常对照组、用药3h组、6h组、12h组和24h组；(3)正常对照组、rhITF组和rhITF+抑制剂组；(4)阴性对照组、rhITF组和rhITF+抑制剂组。 4.培养条件：(1)阴性对照组：DMEM培养液；rhITF组：撤掉血清后分别给予10μg/ml rhITF、25μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF；(2)正常对照组：DMEM培养液+10%小牛血清；不同时相点组：固定rhITF浓度为50μg/ml，分为3h、6h、12h和24h组；(3)正常对照组：同(2)；rhITF组：50μg/ml rhITF；rhITF+抑制剂组：50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黄酮；(4)阴性对照组：DMEM培养液；撤掉血清后分别加入50μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黄酮。 5.检测指标： (1)细胞移行：采用Transwell法，观察肠上皮细胞移行能力的变化。 (2)黏附分子细胞定位和荧光表达：采用免疫荧光法检测黏附分子β-Catenin和E-Cadherin在肠上皮细胞的定位和荧光表达情况。 (3)黏附分子含量：采用Western Blot法观察黏附蛋白β-Catenin和E-Cadherin的蛋白表达变化。 (4)黏附分子磷酸化水平检测：采用Western Blot法检测磷酸化β-Catenin的蛋白表达变化。 结果 1. rhITF促细胞移行能力随其浓度的增加而增强。50μg/ml rhITF组细胞数明显高于阴性对照组、10μg/ml rhITF组和25μg/ml rhITF组，，差异有统计学意义(P＜0.01)；25μg/ml rhITF组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而10μg/ml rhITF组与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P0.05）。 2.β-Catenin和E-Cadherin荧光表达和蛋白表达均受到rhITF抑制，与正常对照组、3h组、6h组和24h组比较，12h组荧光表达和蛋白表达明显减弱(P＜0.05)。 3.在rhITF的刺激下，与正常对照组、3h组、6h组和24h组比较，12h组磷酸化β-Catenin的蛋白表达明显增强(P＜0.05)。 4.在rhITF和抑制剂（染料木黄酮）刺激下，rhITF组磷酸化β-Catenin的蛋白表达强于正常对照组和rhITF+抑制剂组(P0.05)。 5.抑制β-Catenin磷酸化后能明显降低rhITF促进细胞移行的能力。rhITF组细胞数显著高于阴性对照组和rhITF+抑制剂组(P＜0.01)，而rhITF+抑制剂组与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P0.05)。 结论 1．ITF具有促进肠上皮细胞移行的能力。 2．ITF通过抑制细胞间黏附分子β-Catenin与E-Cadherin的表达，降低细胞间黏附力，促进细胞移行。 3．ITF促进细胞移行的核心机制是使β-Catenin磷酸化，削弱β-Catenin和E-Cadherin交联，干扰细胞间黏附，从而促进细胞移行。
【关键词】：肠三叶因子 肠上皮细胞 细胞移行 黏附分子 β-Catenin E-Cadherin 磷酸化
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 一、材料试剂及主要仪器12-17
• （一） 细胞株和病毒12
• （二） 主要试剂和材料12-13
• （三） 主要溶液配制13-16
• （四） 主要仪器16-17
• 二、实验方法17-22
• （一） 细胞培养17
• （二） 细胞传代、冻存与复苏的操作方法17-18
• （三） Transwell 小室迁移实验18
• （四） 免疫荧光检测18-19
• （五） Western blot 检测19-21
• （六） 统计学处理21-22
• 三、结果22-31
• （一） rhITF 对 Caco-2 细胞移行能力的影响22-24
• （二） rhITF 对黏附分子 β-Catenin 和 E-Cadherin 的表达影响24-27
• （三） rhITF 对磷酸化 β-Catenin 的表达影响27-31
• 讨论31-36
• 1.肠三叶因子对肠上皮细胞移行能力的影响31
• 2.肠三叶因子对β-Catenin和E-Cadherin的调控31-33
• 3.肠三叶因子对磷酸化β-Catenin的调控33-35
• 4.研究展望35-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 附录 A 主要英文缩写一览表42-43
• 附录 B 主要工作液的配制43-44
• 附录 C 综述44-50
• 参考文献48-50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 彭曦,汪仕良,陶麟辉,王凤君,赵云,王裴;肠三叶因子与严重烧伤后肠道损伤及修复的关系[J];第三军医大学学报;2000年11期

2 李征;;染料木黄酮生物学功能的研究进展[J];环境与健康杂志;2008年03期

3 张瑞;徐江;;β-catenin和E-cadherin在肿瘤发展中的研究[J];现代生物医学进展;2009年13期

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中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 胡军;E-cadherin与卵巢癌转移的相关性及机制研究[D];大连医科大学;2007年

本文编号：891234