STY及SPA的RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2017-09-21 19:51

  本文关键词：STY及SPA的RT-PCR检测方法的建立

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【摘要】：【目的】 建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量PCR检测法，具体包括：（1）伤寒沙门氏菌SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。（2）伤寒及甲型副伤寒沙门菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。评价以上方法的特异性、敏感性、检测下限、以了解人群中对该菌的携带情况提高感染人群中伤寒及甲型副沙门氏菌的检出率。 【方法】 对建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量PCR检测法，本研究采取以下实验方案： （1）经查阅资料后确定待测目的基因，并通过序列比对确定待检测基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphiA），然后借助探针设计软件Beacon Designer7.7设计单重及双重实时荧光定量PCR引物和探针。 （2）分别在1-10nmol/L10个浓度梯度和2-10nmol/L5个浓度梯度内，在美国Bio-Rad公司的CFX96荧光定量PCR仪上进行扩增比较，优化引物和探针浓度。 （3）SYBR Green实时荧光定量PCR灵敏度、特异度的评价。 （4）SYBR Green法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌，，评价其敏感性、特异度、检测下限、菌液增菌前后的检测下限。 （5）单重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度的评价。 （6）将优化了的单重实时PCR反应体系组合成双重TaqMan实时PCR反应体系，并评价其检测下限。 【结果】 （1）利用SYBR Green法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌纯菌及10份伤寒患者标本均扩增阳性，其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中，实时荧光定量聚合酶链反应法的检测下限为500fg/反应，即97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前检测下限达104cfu/g，增菌后可达50cfu/g。 （2）在单重TaqMan实时荧光定量PCR法检测伤寒沙门菌的反应体系中，优化后的反应体系灵敏度和特异度均为100％。检测伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限为100fg/反应，即19.4个拷贝/反应,扩增效率为90%。以伤寒粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前检测下限即可达1cfu/g。 单重TaqMan实时荧光定量PCR法检测甲型副伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限2.5pg/反应，即485个拷贝/反应，扩增效率为90%。以甲型副伤寒粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前达未检出，但增菌后检测下限可达10cfu/g。 （3）经优化的伤寒和甲型副伤寒双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系中，对两种纯菌DNA的检测下限为分别为1pg/反应和2.5pg/反应，即194个拷贝/反应和485个拷贝/反应。对各自的粪便模拟样品的检测下限分别为：伤寒粪便模拟样品增菌前为102cfu/g，增菌后的检测下限是1cfu/g；甲型副伤寒粪便模拟样品增菌前为104cfu/g，增菌后的检测下限是10cfu/g。 【结论】 本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的实时荧光定量PCR方法。实验结果证明该检测法的特异度、灵敏度及检测下限均较理想。尤其在单重TaqMan实时荧光定量PCR法检测伤寒沙门菌其检测下限能达到19.4个拷贝/反应，高于普通PCR检测法的100-500倍。并且在双重TaqMan实时PCR法能够在一个反应体系中同时检测伤寒和甲型副伤寒两种菌。在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度，为伤寒及甲型副伤寒沙门氏菌的诊断及其他原因不明发热或腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段，对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。
【关键词】：伤寒沙门菌 实时荧光定量聚合酶链反应 甲型副伤寒沙门菌 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法
【学位授予单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 文献综述13-23
• 参考文献19-23
• 第一部分：STY SYBR Green RT-qPCR 体系的建立23-32
• 前言23
• 一、STY SYBR Green RT－qPCR 体系的建立23-31
• 参考文献31-32
• 第二部分：STY 及 SPA 双重 TaqMan RT-PCR 体系的建立32-50
• 前言32-33
• 一、SPA TaqMan RT-PCR 体系的建立33-38
• 二、STY TaqMan RT-PCR 体系的建立38-43
• 三、STY 及 SPA 双重 TaqMan RT-PCR 体系的建立43-46
• 讨论46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-50
• 致谢50-51
• 英文缩写51
• 攻读学位期间发表的学术论文51-52
• 附录52-53

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