人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在果蝇细胞中的稳定表达及鉴定

发布时间：2017-09-22 00:26

  本文关键词：人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在果蝇细胞中的稳定表达及鉴定

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【摘要】：目的：人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）也叫抗白细胞蛋白酶（antileukoprotease, ALP）或分泌性蛋白酶抑制剂（mucousprotease inhibitor, MPI），为黏膜上皮细胞分泌的非糖基化单链多肽蛋白，是一种嗜中性弹性蛋白酶阳离子抑制剂，具有抗细菌、抗人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus, HIV）、抗炎症因子和诱导细胞增殖分化等生物学功能，对创伤组织的愈合也具有重要作用。近来，作为一种潜在的黏膜佐剂，人SLPI在增强黏膜免疫方面的作用引起人们的关注，因此，我们想应用果蝇表达系统，通过稳定转染的方式筛选出能稳定表达人SLPI蛋白的多克隆细胞系，并对其生物学活性进行初步鉴定，为进一步开展了解人SLPI在抗病毒感染及其免疫佐剂等方面的作用奠定基础。 方法：首先从A549细胞中提取细胞总RNA，并反转录获得cDNA。根据人SLPI基因序列，设计上、下游两个引物，并分别加入KpnⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点。利用PCR技术，以A549的cDNA为模板扩增SLPI的开放读码框（open readingframe, ORF）。然后利用DNA重组技术将PCR基因产物克隆入果蝇S2细胞表达载体pMT/V5-HisA中，得到pMT-SLPI真核表达载体。应用磷酸钙转染技术将pMT-SLPI与含有潮霉素B抗性基因的筛选质粒pCoHygro以共转染的方式转染S2细胞，然后用含有300g/ml潮霉素B的完全培养基进行培养，每4-5d更换抗性培养液，大约3-4周便可产生抗性细胞克隆。对克隆细胞加入终浓度为500M的CuSO4诱导表达48h后，收集细胞上清行Western blot检测重组蛋白的表达。并利用RT-PCR的方法检测SLPI在克隆细胞内的转录水平。对不同诱导时间后的细胞上清进行Western blot检测以确定诱导的最佳时间。诱导后的细胞上清浓缩后行胰蛋白酶抑制实验，以观察果蝇S2细胞表达的重组蛋白是否具有良好的生物学活性。 结果：采用RT-PCR技术从A549细胞中得到人SLPI基因ORF，通过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切位点将人SLPI基因ORF序列插入到表达载体中，成功构建了人SLPI的真核表达载体。与抗性筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞后在含有潮霉素的培养液中筛选3-4周，得到能稳定表达人SLPI蛋白的多克隆细胞系，并命名为S2/SLPI。应用CuSO4对S2/SLPI进行诱导并对诱导后的细胞上清通过Western blot检测，可得到大小为12kDa左右的特异性条带，证实目的蛋白的表达，并通过对不同诱导时间段的细胞上清行Western blot检测，确定诱导该蛋白的最佳时间为24h。生物学活性分析显示人SLPI能抑制胰蛋白酶的活性。 结论：利用RT-PCR方法成功克隆了人SLPI基因ORF，并利用果蝇表达系统筛选到可分别稳定表达人SLPI蛋白的多克隆细胞株。S2/SLPI稳定表达细胞株的建立为进一步开展人SLPI促进免疫应答及其在抗病毒感染等方面的作用研究提供了重要基础。
【关键词】：人SLPI 果蝇表达系统 稳定表达 生物学活性
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 实验设计与流程11-12
• 前言12-15
• 实验材料15-19
• 实验方法19-30
• 结果30-36
• 讨论36-37
• 结论37-38
• 参考文献38-41
• 附录41-42
• 致谢42-43
• 综述43-50
• 参考文献48-50

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本文编号：897755