涎腺分泌蛋白Salp15对全沟硬蜱传播莱姆病螺旋体效能的影响

发布时间：2017-09-23 05:16

  本文关键词：涎腺分泌蛋白Salp15对全沟硬蜱传播莱姆病螺旋体效能的影响

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【摘要】：为了吸取宿主的营养物质,蜱吸血过程中会分泌涎液涎液能够阻碍宿主凝血,抑制宿主的炎症反应并改变其免疫应答,最终也影响着其作为媒介传播病原的能力涎腺激促的病原体传播(Salivary active transmission,SAT)是蜱媒病传播的主要方式,分离及鉴定涎腺中具有生物活性的物质,将是明确媒介蜱与病原及宿主之间的关系的必须步骤,对于揭示蜱类传播病原体的生理机制具有十分重要的科学机制,也将可从传播阻断角度开发新型疫苗以应对层出不穷的蜱媒疾病本文基于全沟硬蜱对多种病原体,如细菌原虫病毒立克次体等的高效传播能力,以莱姆病为蜱媒病代表,通过对全沟硬蜱的涎腺蛋白Salp15编码序列的克隆原核表达得到涎腺蛋白Salp15,利用动物免疫和实验传播来探讨全沟硬蜱涎腺在莱姆病螺旋体感染和传播中的地位和作用,以期揭示蜱类涎腺对病原体的作用机制,继而从传播阻断角度探索利用涎腺蛋白阻断蜱媒病原体传播的可能性和可行性 1.全沟硬蜱复合组Salp15蛋白超家族多样性 本文利用涎腺RNA逆转录技术研究了Salp15蛋白在全沟硬蜱涎腺的基因编码转录及表达情况,结果表明,全沟硬蜱的Salp15基因仅在叮咬吸血阶段转录,而在非叮咬的状态下未检测到转录;对吸血期全沟硬蜱的检测,获取了全沟硬蜱5条唾液腺蛋白Salp15序列:Ipers-2Ipers-3Ipers-4Ipers-1Ipers-5,其中于幼蜱中扩增出Ipers-2Ipers-3Ipers-4,若蜱中扩增出Ipers-1,成蜱中扩增出Ipers-5;经氨基酸序列相似性比较,Ipers-3与篦子硬蜱的iric-3相似性最大,达94.4%,Ipers-2与Ipers-3相似性其次达89.1%,Ipers-2与iric-2相似性最小为53.1%;一种蜱中可以同时表达多种Salp15蛋白成员,即呈现出多样性结合全沟硬蜱复合组其他成员的Salp15的转录情况(如本课题组完成的中华硬蜱的转录情况),综合分析,Salp15的转录及表达是多样性的 2.全沟硬蜱涎腺分泌蛋白Salp15的融合表达 为了应对分泌型蛋白表达的特殊性,本文在对Salp15蛋白序列的分析和预测的基础上,通过添加MBP标签序列的的策略,以pMal-c4x载体为基骨构建了重组表达载体,转染大肠杆菌Transetta DE3细胞后实现了salp15蛋白的表达,并得到了Western-blotting法特异性检测验证,该融合蛋白Ipers-5亲和层析纯化后,浓度达到1.2mg/ml,纯度达到93%Factor Xa酶切去除融合蛋白的MBP标签后,得到了与预期分子量大小一致的蛋白片段15kDa,为之后的免疫学实验及传播阻断实验奠定了基础 3.Salp15蛋白Ipers-5对螺旋体的传播阻断效应初步评价 以螺旋体敏感系C3H鼠作为免疫实验动物,两种螺旋体菌株Borreliaburgdorferi sense lato B31, Borrelia garinii NMJW-1为实验菌株通过腹腔注射及蜱虫叮咬传播的方法传染螺旋体,非免疫组小鼠皆检测到高载量的螺旋体,而免疫组中的螺旋体感染量显著降低,初步展示了Salp15抗体对螺旋体感染和传播的阻断作用 综上所述:全沟硬蜱涎腺Salp15基因仅在吸血阶段转录或表达,Salp15基因的转录和表达在不同发育阶段转录有差异性,导致了Salp15蛋白多样性的产生利用pMal-c4x重组表达和质粒和大肠杆菌Transetta DE3,可成功表达Salp15蛋白所表达的Salp15蛋白能够有效诱导C3H小鼠高滴度的抗体产生;莱姆病螺旋体敏感C3H小鼠,经免疫Salp15蛋白后可有效降低螺旋体感染和传播,展示了良好的传播阻断潜能
【关键词】：全沟硬蜱 Salp15 唾液腺 传播阻断性疫苗
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R377
【目录】：

• 缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-16
• 一 全沟硬蜱复合组Salp15蛋白超家族的多样性16-30
• 1.1 全沟硬蜱Salp15编码序列的扩增16-20
• 1.2.1 材料16
• 1.2.2 方法16-20
• 1.2.2.1 全沟硬蜱唾液腺蛋白Salp15 CDS序列扩增引物设计17
• 1.2.2.2 全沟硬蜱叮咬17-18
• 1.2.2.3 半饱血蜱RNA提取18
• 1.2.2.4 聚合酶链式反应扩增目的基因及克隆18-20
• 1.3 实验结果20-24
• 1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测全沟硬蜱RNA20-21
• 1.3.2 Salp15 目的片段的扩增和克隆21-24
• 1.4 讨论24-30
• 1.4.1 硬蜱属蜱类Salp15蛋白的多样性24-29
• 1.4.2 全沟硬蜱Salp15蛋白家族在转录水平上的多样性29
• 1.4.3 全沟硬蜱Salp15蛋白Ipers-529-30
• 二 Salp15蛋白Ipers-5融合蛋白表达体系建立及优化30-44
• 1.1 材料30-33
• 1.2 方法33-38
• 1.2.1 表达载体构建33-35
• 1.2.2 诱导表达融合蛋白35-36
• 1.2.3 融合蛋白的纯化36-37
• 1.2.4 酶切重组蛋白,去MBP标签蛋白37
• 1.2.5 纯化去标签的融合蛋白37-38
• 1.2.6 Western-blotting38
• 1.3 结果38-43
• 1.3.1 阳性克隆鉴定结果38-39
• 1.3.2 融合蛋白的表达39-41
• 1.3.3 融合蛋白纯化41-42
• 1.3.4 Western-blotting分析融合蛋白42
• 1.3.5 融合蛋白去标签并纯化42-43
• 1.4 讨论43-44
• 三 Salp15家族蛋白对莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi(B31)、Borreliagarnii(VH7)感染的拮抗作用44-58
• 1 实时荧光定量检测螺旋体方法的建立44-52
• 1.1 材料44
• 1.2 方法44-47
• 1.2.1 菌种的培养与保存44
• 1.2.2 螺旋体基因组提取44-45
• 1.2.3 小鼠血液基因组提取45
• 1.2.4 莱姆病螺旋体目的基因Flagellin扩增45-46
• 1.2.4.1 Borrelia garinii目的基因扩增45
• 1.2.4.2 Borrelia burgdorferi目的基因扩增45-46
• 1.2.4.3 Taqman法荧光定量PCR绘制Flagellin基因标准曲线46
• 1.2.5 Taqman法荧光定量PCR绘制小鼠的β-actin基因标准曲线46-47
• 1.3 结果47-51
• 1.3.1 螺旋体鞭毛蛋白基因的扩增47-48
• 1.3.2 两株螺旋体鞭毛蛋白目的基因片段标准曲线生成48-50
• 1.3.3 小鼠β-actin基因片段的扩增50-51
• 1.4 讨论51-52
• 2 全沟硬蜱Salp15蛋白Ipers-5对莱姆病螺旋体传播阻断效应52-58
• 2.1 材料52
• 2.2 方法52-54
• 2.2.1 Salp15免疫C3H小鼠的实验方案52
• 2.2.2 间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价52-53
• 2.2.3 感染螺旋体53-54
• 2.2.3.1 随机分组小鼠53
• 2.2.3.2 腹腔注射感染小鼠53
• 2.2.3.3 感染蜱叮咬小鼠53-54
• 2.2.3.4 qPCR定量检测螺旋体感染量54
• 2.3 结果54-57
• 2.3.1 小鼠抗体效价检测54
• 2.3.2 普通PCR检测螺旋体结果54-55
• 2.3.3 相对荧光定量法检测结果55-57
• 2.4 讨论57-58
• 结论58-59
• 参考文献59-66
• 综述66-77
• References73-77
• 附录77-79
• 附录1 本人简历77-78
• 附录2 在学期间研究成果目录78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 程远国,吴厚永,李德昌;长角血蜱唾液腺中胶原特异性血小板聚集抑制因子的纯化及机制的研究[J];中国科学C辑:生命科学;1999年06期

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本文编号：903404