人工诱导空肠弯曲菌红霉素耐药株的生物学特性及蛋白质组学分析

发布时间：2017-09-26 04:13

  本文关键词：人工诱导空肠弯曲菌红霉素耐药株的生物学特性及蛋白质组学分析

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【摘要】：空肠弯曲菌'Campylobacter jejuni)是重要的人兽共患病原菌,能引起人的腹泻性肠炎。在少数情况下,空肠弯曲菌的感染会导致格林-巴利综合症。大环内酯类的红霉素是治疗空肠弯曲菌病的首选药物。但随着红霉素的广泛使用,空肠弯曲菌对红霉素耐药率不断升高,空肠弯曲菌红霉素的耐药性已成为一个重要的临床问题。因此,研究和克服空肠弯曲菌对红霉素的耐药性问题,探索和发现其耐药机制,对研发低毒、高效、选择性强的抗菌药物具有重要意义。 随着分子生物学的迅速发展,空肠弯曲菌红霉素的耐药机制研究取得了一些进展,但还不能完全来解释空肠弯曲菌红霉素耐药的形成。空肠弯曲菌对红霉素耐药性的获得是多层次多基因水平的变异积累过程,所以可以从整体水平上分析空肠弯曲菌红霉素耐药相关蛋白的表达,鉴定并了解其功能。 本研究的目的是：(1)建立体外诱导空肠弯曲菌红霉素耐药株的方法,分析耐药基因的突变对空肠弯曲菌红霉素耐药株生理特性的影响。(2)利用二维电泳技术分析比较空肠弯曲菌红霉素耐药株与其亲本敏感株的蛋白质组学特性,寻找空肠弯曲菌红霉素耐药株可能的耐药相关蛋白。 一、空肠弯曲菌红霉素耐药株的诱导及其生物学特性的研究 本研究通过将空肠弯曲菌红霉素敏感株在红霉素梯度平板上不断地传代筛选,最终获得7株空肠弯曲菌红霉素耐药株RGXY122R、d-2-3R、C31-10R、SO-12-5R、PO-13-9R、PO-19-5R、11168R。测定这7株耐药株的稳定性、生化反应和药敏,结果显示诱导的耐药株在无抗的平板上传30代后,仍能生长于高浓度红霉素的平板上,且耐药性的改变对该菌代谢方面没有显著的影响；空肠弯曲菌红霉素耐药性获得后,不影响其对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、四环素类及氨基糖苷类抗生素的耐药性。建立了可靠的体外诱导空肠弯曲菌红霉素耐药株的模型。 对空肠弯曲菌人工诱导红霉素耐药株和天然耐药株的耐药基因和外排泵的检测结果显示,诱导耐药株RGXY122R、d-2-3R、C31-10R发生了23S rRNA基因的突变,SO-12-5R、 PO-13-9R、PO-19-5R、11168R同时发生了rplD和rplV基因的突变,而天然耐药株则只发生23S rRNA基因的突变。诱导耐药株23S rRNA基因的突变在2074位点,而天然耐药则在2075位点。诱导耐药和天然耐药都不发生cmeB基因的突变。外排泵都能降低诱导耐药株与天然耐药株对红霉素的耐药性。这一结果表明空肠弯曲菌红霉素诱导耐药株比天然耐药株具有多样、复杂的耐药机制。 将诱导空肠弯曲菌产生红霉素耐药性的传代次数及耐药株的来源、药敏、毒力和增殖能力与耐药基因的突变类型结合分析显示空肠弯曲菌禽源株倾向于发生23S rRNA基因突变,而人源株则倾向于发生rplD和rplV基因的突变。23S rRNA基因的突变能产生高水平的耐药,但其对人肠上皮细胞Caco-2和鸡巨噬细胞HD-11的黏附侵袭率及在鸡巨噬细胞HD-11中增殖能力是下降的,同时23S rRNA基因的突变还能引起克林霉素的耐药。而rplD和rplV基因能引起低水平的红霉素耐药,增殖能力降低。 二、空肠弯曲菌红霉素诱导耐药株与其亲本敏感株的比较蛋白质组学研究 本研究通过丙酮-三氯醋酸沉淀法提取空肠弯曲菌红霉素诱导耐药株11168R与其亲本敏感株11168的菌体蛋白。用7cm pH3-10的胶条进行二维电泳发现蛋白点主要集中于pH4-7之间,在用17cm pH4-7的胶条重复进行3次二维电泳,PDQust8.0软件分析,大约共鉴定出500个蛋白点,其中9个在耐药株中是上调的,2个下调。这11个差异蛋白点经质谱成功鉴定,将11个鉴定成功的蛋白进行功能分类,分别有5个能量代谢相关蛋白、3个毒力相关蛋白、2个转录翻译相关蛋白及1个生物合成相关蛋白。能量代谢相关蛋白上调说明空肠弯曲菌在耐药形成过程中,对能量的需求增加；毒力相关蛋白上调,说明空肠弯曲菌获得红霉素耐药后,毒力增加。其中GalU、Enolase、NusG、FusA蛋白经STRING9.05软件分析能与核糖体蛋白相互作用,是可能的耐药相关蛋白。通过荧光定量PCR验证二维电泳,结果显示除了fumC和fba基因在mRNA水平上无明显差异,其余基因在mRNA水平表达差异与二维电泳结果一致。
【关键词】：空肠弯曲菌 红霉素耐药 诱导耐药 二维电泳 耐药相关蛋白
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.3;R3411
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 目录7-8
• 符号说明8-9
• 综述 空肠弯曲菌的红霉素耐药机制及其蛋白质组学研究进展9-19
• 1 空肠弯曲菌红霉素的耐药现状9-10
• 2 空肠弯曲菌对红霉素的耐药机制10-11
• 3 空肠弯曲菌特异突变位点改变的检测11-12
• 4 空肠弯曲菌蛋白质组学研究现状12-14
• 5 总结和展望14-15
• 参考文献15-19
• 第一章 空肠弯曲菌红霉素耐药株的诱导及其生物学特性的研究19-38
• 1 材料和方法19-23
• 2 结果23-32
• 3 讨论32-35
• 参考文献35-38
• 第二章 空肠弯曲菌红霉素诱导耐药株与亲本敏感株的比较蛋白质组学研究38-59
• 1 材料和方法38-48
• 2 结果48-54
• 3 讨论54-57
• 参考文献57-59
• 致谢59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 海泉;张焕容;杨发龙;岳华;;空肠弯曲菌耐药机制研究进展[J];动物医学进展;2009年02期

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本文编号：921403