自噬通路在泛素连接酶Hrd1介导的α1-抗胰蛋白酶Z突变体降解中的作用

发布时间：2017-09-26 06:23

  本文关键词：自噬通路在泛素连接酶Hrd1介导的α1-抗胰蛋白酶Z突变体降解中的作用

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【摘要】：α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin, AAT）属于丝氨酸蛋白酶超家族成员，由肝细胞合成和分泌，可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多种蛋白酶活性，但其主要作用是通过血液循环到达肺部，保护肺组织弹力纤维免受中性粒细胞弹性蛋白酶的水解和破坏。AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，由于编码AAT蛋白的基因突变而引起AAT分泌障碍所致，其中最常见的突变为Z型突变，占临床病例的95%以上，该突变编码的蛋白为AAT Z突变体(α1-antitrypsin Z variant,ATZ)。我们的前期研究发现，泛素连接酶Hrd1可促进泛素-蛋白酶体通路介导的细胞内ATZ降解，且Hrd1显著降低SDS不溶性和多聚体ATZ的水平。 目的： 观察Hrd1是否可以通过自噬通路介导ATZ降解，同时探究其相关作用机制。 方法： 1.利用免疫荧光双标观察细胞形态和蛋白定位情况； 2.分别加入放线菌酮(cycloheximide, CHX)抑制蛋白质的合成，MG132抑制蛋白酶体活性，HBSS培养液诱导自噬，BFA1和氯化铵抑制自噬； 3.利用siRNA技术，合成Hrd1-siRNA抑制内源性Hrd1表达，观察ATZ降解的情况； 4. real-time PCR技术检测共表达Hrd1和ATZ后对自噬相关基因Atg5，Atg12和Beclin-1的影响； 5.免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测ATZ与K48位泛素、p62之间的相互作用。 结果： 1.自噬参与Hrd1介导的ATZ降解 1.1Hrd1促进ATZ与自噬体膜蛋白LC3共定位 哺乳动物细胞内存在两种形式的LC3，即18kDa的LC3-I和16kDa的LC3-II。LC3-I广泛分布于胞浆中，当自噬发生时，Atg7活化LC3并促使LC3与Atg3结合，LC3-I与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）结合称为LC3-II，LC3-II定位于自噬体膜的两侧。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬泡的数量呈正相关。因此为了了解ATZ、Hrd1和细胞自噬体膜蛋白LC3在细胞内的定位情况，HEK293T细胞共转染ATZ和Hrd1，并用NH4Cl抑制溶酶体酶活性，同时设立DMSO组作为对照，细胞爬片免疫染色。免疫荧光双标结果显示在氯化铵抑制溶酶体后，共表达ATZ和Hrd1可使细胞浆中的LC3-II发生大量的点状聚集，且Hrd1可促进ATZ与LC3共定位，提示Hrd1可能介导ATZ到达溶酶体中降解。 1.2自噬诱导和抑制对Hrd1介导ATZ降解的影响 为了进一步确定Hrd1是否介导ATZ通过自噬途径降解，我们在293T细胞中共转染ATZ和Hrd1后，首先我们使用放线菌酮(cycloheximide, CHX)来阻断ATZ蛋白的合成，再分别加入自噬诱导剂HBSS和自噬抑制剂巴佛洛霉素A1（BafilomycinA1，，BFA1），设立空载体对照，免疫印迹检测细胞内ATZ水平变化。实验结果显示，与DMSO组相比，饥饿诱导自噬后，Hrd1能够显著下调ATZ的蛋白水平；溶酶体抑制剂BFA1可部分抑制Hrd1的作用。 1.3抑制内源性Hrd1表达对ATZ自噬降解的影响 293T细胞中共转染ATZ和Hrd1-siRNA，设立空载体对照，观察内源性Hrd1表达抑制后对ATZ自噬降解的影响。免疫印迹结果显示，与对照组相比，抑制内源性Hrd1的表达使细胞内ATZ水平增高。 1.4Hrd1对ATZ的自噬降解与其E3活性有关 为了进一步明确Hrd1介导ATZ的自噬降解是否与其E3活性有关，我们分别将HEK293T细胞共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24hrs后在细胞的培养上清液中加入BFA1，然后检测细胞内的ATZ水平。结果发现，Hrd1C1A不能促进ATZ的降解，加入BFA1后细胞内ATZ水平也无明显变化。提示Hrd1介导的ATZ自噬降解与其E3活性有关。 1.5Hrd1介导不溶性ATZ通过自噬降解 以前的研究发现Hrd1在降低ATZ总体水平的同时轻度增加SDS可溶性ATZ水平，显著降低SDS不溶性和多聚体ATZ的水平，且有研究发现自噬通路主要降解ATZ的聚集体部分，据此我们推测Hrd1是否介导不溶性ATZ通过自噬通路降解。为了验证这一设想，我们用免疫印迹实验分别检测细胞上清和沉淀中的ATZ，实验结果发现，Hrd1能明显降低沉淀中ATZ的水平，而加入NH4Cl后抑制了Hrd1介导的ATZ降解，该结果提示Hrd1可通过自噬通路介导不溶性ATZ降解。 1.6Hrd1对自噬相关基因Atg5，Atg12和Beclin-1的影响 通常情况下，细胞自噬的发生依赖于一系列Atg家族蛋白，其中Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，通过与Class Ⅲ PI3K形成复合物参与自噬体初期自噬体膜的形成；另外，Atg5在细胞内形成Atg12-Atg5复合物，能促使LC3-I向LC3-II的转变，对自噬体膜的延伸至关重要。为了进一步验证Hrd1对自噬的影响，我们在HEK293T中共表达ATZ与Hrd1，提取RNA进行real-timePCR检测Atg5、Atg12以及Beclin1的mRNA水平。实验结果发现，共表达ATZ和Hrd1明显增加自噬相关基因Atg5、Atg12的mRNA水平，Beclin1水平也有所提高。 2Hrd1促进ATZ K48位点泛素化 泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链，因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解。靶蛋白的泛素化降解是一个涉及E1泛素激活酶，E2泛素结合酶，以及E3泛素连接酶的酶促反应。一个泛素分子内部的七个赖氨酸残基（K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63）之一和前面的泛素分子形成一个多聚泛素链。不同的泛素化连接方式有不同的生物学功能，例如K48连接的多泛素链介导泛素化靶蛋白进行蛋白酶体降解，K63连接的多泛素化最近已经显示出参与多种细胞过程，包括细胞内吞作用，信号转导和DNA损伤的调节等与蛋白酶体无关的作用。为了探究Hrd1介导ATZ的泛素化方式，HEK293T共转染Hrd1和ATZ，加入自噬抑制剂BFA1，免疫荧光双标结果显示Hrd1和ATZ可以与K48共定位，而与K63无共定位。免疫共沉淀结果提示ATZ与Hrd1以及K48可能存在相互作用，Hrd1可能促进ATZ的K48位泛素化。 3. p62参与Hrd1介导的ATZ的自噬通路降解 3.1Hrd1与ATZ及p62共定位 p62是自噬发生发展过程中起重要作用的蛋白。大量研究结果表明：泛素化的蛋白能够通过p62的UBA结构域与p62发生结合，而p62又可通过其自身的LIR区域与自噬体膜蛋白LC3直接相互作用形成三者的复合物，并由LC3转运至自噬体，最后通过自噬体/溶酶体降解，p62本身也能被自噬降解，故p62可作为自噬活性的标志分子。前述实验已经证实Hrd1可以泛素化ATZ，我们想知道泛素化的ATZ是否与p62相互作用。首先我们在293T细胞转染ATZ和Hrd1，24hrs后加入自噬抑制剂BFA1，6hrs后固定细胞，免疫荧光染色标记ATZ、Hrd1和p62三种蛋白，激光共聚焦显微镜观察三者在细胞内的定位情况，结果显示三者在细胞内共定位。 3.2ATZ与p62相互作用 为了进一步证实Hrd1、ATZ与p62之间的相互作用，293T细胞转染ATZ和Hrd124hrs后，加入自噬抑制剂BFA1，6hrs后收集细胞裂解，免疫沉淀AAT后免疫印迹观察p62与ATZ的相互作用，结果显示ATZ与p62存在相互作用。结论Hrd1可介导ATZ K48位点泛素化，促进泛素化的ATZ与p62的相互作用识别并结合，从而促进自噬体中溶酶体途径介导的ATZ降解。
【关键词】：α1抗胰蛋白酶 Z型突变体 自噬 Hrd1 p62 LC3
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 中文摘要8-13
• ABSTRACT13-19
• 1 前言19-20
• 2 实验材料20-22
• 2.1 菌株及细胞株20
• 2.2 质粒20
• 2.3 抗体20-21
• 2.4 主要试剂21
• 2.5 引物和 siRNA21
• 2.6 主要仪器和设备21-22
• 3 实验方法22-32
• 3.1 主要试剂溶液的配方22-24
• 3.2 质粒中抽24-25
• 3.3 siRNA 的合成25-26
• 3.4 细胞培养和转染26
• 3.5 免疫印迹26-28
• 3.6 real time-PCR28-30
• 3.7 CHX 示踪实验30
• 3.8 蛋白酶体抑制实验30-31
• 3.9 自噬诱导及其检测31
• 3.10 自噬抑制及其检测31
• 3.11 免疫细胞染色31-32
• 3.12 免疫共沉淀32
• 4 结果32-44
• 4.1 自噬参与 Hrd1 介导的 ATZ 降解32-39
• 4.1.1 Hrd1 促进 ATZ 与自噬体膜蛋白 LC3 共定位32-33
• 4.1.2 自噬诱导和抑制分别对 Hrd1 介导 ATZ 降解的影响33-35
• 4.1.3 抑制内源性 Hrd1 表达对 ATZ 自噬降解的影响35-36
• 4.1.4 Hrd1 对 ATZ 的自噬降解与其 E3 活性有关36-37
• 4.1.5 Hrd1 主要介导不溶性 ATZ 通过自噬降解37-38
• 4.1.6 共表达 Hrd1 和 ATZ 对 Atg5，Atg12 和 Beclin1 的影响38-39
• 4.2 Hrd1 促进 ATZ K48 位点泛素化39-42
• 4.3 p62 参与 Hrd1 介导 ATZ 的自噬通路降解42-44
• 4.3.1 Hrd1 与 ATZ 及 p62 共定位42
• 4.3.2 ATZ 与 p62 相互作用42-44
• 5 讨论44-47
• 6 结论47
• 7 本研究的创新点47-48
• 8 参考文献48-52
• 附录52-54
• 致谢54-55
• 综述55-65
• 参考文献61-65

【共引文献】

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本文编号：921948