HRSP12慢病毒载体的构建、功能研究及RYBP核定位信号的鉴定

发布时间：2017-09-27 07:04

  本文关键词：HRSP12慢病毒载体的构建、功能研究及RYBP核定位信号的鉴定

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【摘要】：热反应蛋白12(Heat-responsive protein12, HRSP12)于1995年从溶于5%高氯酸的大鼠肝脏组织中首先被发现。鉴定发现其属于YER057c/YIL051c/YjgF家族成员,主要在肝脏和肾脏组织中有较高表达,具核糖核酸酶活性,通过降解mRNA抑制蛋白质合成,进而抑制细胞增殖。研究表明,HRSP12与肿瘤的发生有关,能够抑制DMBA诱导的大鼠乳腺癌细胞的生长。近期的研究还发现,HRSP12的mRNA和蛋白质水平在人肝细胞癌组织中的表达明显低于癌旁的正常组织。因此,我们希望通过对HRSP12的研究,了解HRSP12在肿瘤发生发展及凋亡诱导中的作用机理。 RYBP是多梳蛋白家族成员,参与多梳蛋白抑制复合物1(Polycomb repressive complex1, PRC1)的组成,抑制Hox基因和分化相关基因等的表达,在个体发育、干细胞分化、X染色体失活和肿瘤发生等过程中发挥重要作用。RYBP还可与多个凋亡调节蛋白相互作用,比如与细胞质中的FADD、Pro-Caspase8/10、Hippi和Apoptin,以及细胞核中的DEDD等相互作用,在胞质和胞核中促进肿瘤细胞的凋亡。RYBP还可以通过与MDM2相互作用,抑制MDM2对p53蛋白的泛素化降解,稳定和激活p53的活性,引发肿瘤细胞周期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖。前期的研究已经发现RYBP蛋白主要定位在细胞核内,并在细胞质中少量分布。尽管RYBP蛋白可以定位于细胞核,但是该蛋白核定位的结构基础知之甚少。 本论文的第一部分是构建HRSP12的慢病毒表达载体,感染宫颈癌HeLa细胞,并用Western blot检测感染细胞内Flag-HRSP12融合蛋白的表达。研究发现,慢病毒介导的过表达的HRSP12能够促进宫颈癌HeLa细胞中Caspase-3的剪切,并抑制细胞增殖,表明HRSP12在抑制肿瘤细胞增殖的同时还可能与诱导细胞的凋亡有关。 本论文的第二部分是利用生物信息学分析结合DNA重组技术,构建了一系列RYBP基因截短体或突变体与GFP绿色荧光蛋白基因融合的重组质粒,分别转染三株肿瘤细胞,在激光共聚焦显微镜下观察GFP-RYBP截短体／突变体融合蛋白在不同细胞内的定位。结果显示,RYBP蛋白中的3段序列--6KKSPTRPKR14、47RKGTSTRKPR56及74PPPKKEKKEKVEKQDK89具有核定位功能,3段序列单独与GFP融合后主要定位于细胞核内,第3段序列可以引导只在细胞质内定位的PKLR(丙酮酸激酶)进入细胞核,基本确定了这3段序列为RYBP的核定位信号。进一步将这3段序列中的4个碱性氨基酸突变为丙氨酸,构建了RYBP全长的胞质定位的突变体RYBPmut,用Western blot检测RYBPmut在HEK293T细胞中对p53蛋白的作用,结果显示,与野生型RYBP蛋白相比,在细胞质内定位的RYBPmut蛋白更能够增加细胞内p53的蛋白水平,其具体的作用机制还需要深入研究。 综上所述,本论文利用HRSP12慢病毒表达载体证实,HRSP12蛋白可以诱导HeLa细胞凋亡并抑制其增殖,为HRSP12的深入研究提供了线索。首次鉴定了RYBP蛋白中的核定位序列,构建了胞质定位的突变体RYBPmut,发现其能够增加细胞内p53的蛋白水平,初步揭示了RYBP蛋白中核定位的氨基酸顺序,为深入研究RYBP这一新的肿瘤抑制因子诱导细胞凋亡的分子机制提供了新的依据。
【关键词】：HRSP12 慢病毒载体 RYBP 核定位信号
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词8-10
• 前言10-17
• 1. HRSP12蛋白10-13
• 2. RYBP蛋白13-17
• 实验材料17-31
• 1. 菌株17
• 2. 哺乳动物细胞株17
• 3. 引物17-23
• 4. 载体23-26
• 5. 仪器设备26-27
• 6. 试剂27-28
• 7. 试剂配制28-31
• 第一部分 HRSP12慢病毒表达载体的构建、表达及对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响31-47
• 1. 实验方法31-41
• 2. 实验结果41-45
• 3. 讨论45-47
• 第二部分 RYBP蛋白质核定位信号的鉴定、胞质定位全长突变体的构建及功能研究47-77
• 1. 实验方法47-49
• 2. 实验结果49-73
• 3. 讨论73-77
• 总结77-78
• 参考文献78-81
• 致谢81-83
• 个人简介83-84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 马雯;陈虹;黄秉仁;陈等;;RYBP慢病毒表达载体的构建及对结肠癌细胞HCT116增殖的影响[J];医学研究杂志;2013年09期

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本文编号：928273