小鼠肥大细胞蛋白酶4、6的原核表达和多克隆抗体制备

发布时间：2017-09-28 02:34

  本文关键词：小鼠肥大细胞蛋白酶4、6的原核表达和多克隆抗体制备

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【摘要】：在肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化和腹主动脉瘤等代谢疾病发病机制中，肥大细胞起着重要的作用。小鼠肥大细胞蛋白酶4、6（mMCP4、mMCP6）是小鼠肥大细胞特异蛋白酶，在肥大细胞相关疾病生物学中具有关键的调控作用。但是，，市场上并没有较好的商品化抗体，在一定程度上限制了这些肥大细胞蛋白酶细节作用机制的研究。因此，原核表达并制备这些蛋白酶的抗体，将有利于深入探讨肥大细胞的相关作用机制。 本研究，构建了小鼠肥大细胞蛋白酶4(mMCP4)和6(mMCP6)的原核表达体系，诱导表达并纯化了包涵体蛋白，并通过多次皮下注射制备了兔抗mMCP4和兔抗mMCP6多克隆抗体。 其具体方法包括：(1)提取小鼠脾细胞总RNA，运用RT-PCR技术获得目的基因mMCP4、 mMCP6；(2)构建重组原核表达载体pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6，将其转化到大肠杆菌BL21中，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达；(3)利用Ni亲和层析柱纯化mMCP4、mMCP6融合蛋白；(4)纯化后重组蛋白作为抗原免疫兔子获得mMCP4多克隆抗体、mMCP6多克隆抗体；(5)采用ELISA法测抗体效价，western blot测抗体特异性。 其具体结果表明：(1)经测序验证，所扩增目的基因mMCP4、mMCP6序列准确，所构建重组表达质粒pET28a-mMCP4、 pET28a-mMCP6成功；(2)经SDS-PAGE电泳验证，所诱导并纯化的mMCP4、mMCP6融合包涵体蛋白分子量符合预期，条带单一；(3)经ELISA测定，所得兔抗mMCP4血清和兔抗mMCP6血清效价分别达到1:128000和1:32000；(4)经western blot和免疫组化分析，表明mMCP4、mMCP6多克隆抗体具有较好的特异性。 总之，通过克隆、原核表达和多次免疫，我们成功地获得两种具有良好的效价和特异性的抗体，可用于免疫学检测法，能满足利用之进一步研究肥大细胞的生物学功能的要求。
【关键词】：小鼠肥大细胞蛋白酶4(mMCP4) 小鼠肥大细胞蛋白酶6(mMCP6) 原核表达 抗体制备
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 致谢8-14
• 第一章 绪论14-25
• 1.1 肥大细胞相关代谢疾病的研究背景14-16
• 1.1.1 肥胖相关代谢疾病15
• 1.1.2 肥大细胞与肥胖15-16
• 1.1.3 相关功能食品对肥胖的作用16
• 1.2 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶简介16-18
• 1.2.1 类糜蛋白酶简介16
• 1.2.2 类胰蛋白酶简介16-17
• 1.2.3 类胰蛋白酶的生物学效应17-18
• 1.3 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶相关疾病18-23
• 1.3.1 类胰蛋白酶的研究进展19-20
• 1.3.2 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶在哮喘中的作用20-21
• 1.3.3 类糜蛋白酶与组织纤维化21
• 1.3.4 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶在心血管疾病中的作用21-22
• 1.3.5 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶与肿瘤的关系22
• 1.3.6 类胰蛋白酶与皮肤炎症22
• 1.3.7 类胰蛋白酶与关节炎症22-23
• 1.3.8 类胰蛋白酶与其他疾病23
• 1.4 小鼠肥大细胞蛋白酶研究背景23-25
• 1.4.1 mMCP4 的研究背景23-24
• 1.4.2 mMCP6 的研究背景24-25
• 第二章 小鼠肥大细胞蛋白酶 4 的原核表达25-36
• 2.1 材料与方法25-32
• 2.1.1 主要试剂25
• 2.1.2 主要仪器25-26
• 2.1.3 菌株和载体26
• 2.1.4 实验动物26
• 2.1.5 实验方法26-32
• 2.2 结果与分析32-35
• 2.2.1 RT-PCR 扩增 mMCP432-33
• 2.2.2 重组原核表达载体 pET28a-mMCP4 的构建33
• 2.2.3 SDS-PAGE 检测重组蛋白 mMCP4 在大肠杆菌 BL21 中的表达33-34
• 2.2.4 融合蛋白 mMCP4 的纯化34-35
• 2.3 讨论35-36
• 第三章 兔抗 mMCP4 多克隆抗体的制备36-43
• 3.1 材料与方法36-40
• 3.1.1 主要试剂36
• 3.1.2 主要仪器36-37
• 3.1.3 实验动物37
• 3.1.4 实验方法37-40
• 3.2 结果与分析40-41
• 3.2.1 ELISA 法检测抗血清效价40
• 3.2.2 western blot 检测40-41
• 3.2.3 免疫组化41
• 3.3 讨论41-43
• 第四章 小鼠肥大细胞蛋白酶 6 的原核表达43-49
• 4.1 材料与方法43-46
• 4.1.1 主要试剂43
• 4.1.2 主要仪器43
• 4.1.3 菌株和载体43
• 4.1.4 实验动物43
• 4.1.5 实验方法43-46
• 4.2 结果与分析46-48
• 4.2.1 RT-PCR 扩增目的基因46
• 4.2.2 pET28a-mMCP6 表达载体的构建46-47
• 4.2.3 SDS-PAGE 检测重组蛋白 mMCP6 在大肠杆菌 BL21 中的表达47
• 4.2.4 融合蛋白 mMCP6 的纯化47-48
• 4.3 讨论48-49
• 第五章 兔抗 mMCP6 多克隆抗体的制备49-52
• 5.1 材料与方法49
• 5.1.1 主要试剂49
• 5.1.2 主要仪器49
• 5.1.3 实验动物49
• 5.1.4 实验方法49
• 5.2 结果与分析49-51
• 5.2.1 ELISA 法检测抗血清效价49-50
• 5.2.2 western blot 检测50
• 5.2.3 免疫组化50-51
• 5.3 讨论51-52
• 第六章 展望52-53
• 参考文献53-60
• 硕士期间发表的论文60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 卫志燕;高彩荣;;类糜蛋白酶与疾病的关系研究[J];山西职工医学院学报;2009年02期

2 李军;王晓敏;窦忠英;李勇;;Nanog基因的原核表达及抗体制备[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年07期

本文编号：933356