携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

发布时间：2017-09-28 19:20

  本文关键词：携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

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【摘要】：目的 构建携带人超级化环化核苷酸门控阳离子通道4基因(hHCN4基因)的重组腺病毒载体（Ad-hHCN4-IRES/eGFP）在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，目的检测含hHCN4基因的BMSCs中是否有mRNA和蛋白水平的表达，以求证实hHCN4基因在BMSCs中能够表达，为进步证实携带hHCN4基因的BMSCs具有起搏功能提供依据，为构建基因和细胞相结合的生物起搏治疗奠定实验基础。 方法 1.分离纯化和培养传代大鼠BMSCs及鉴定：分离纯化采用密度梯度离心法，培养传代采用贴壁培养法，用倒置显微镜观察活细胞形态学的动态变化，免疫细胞荧光法鉴定其表面抗原； 2.在体外将已经构建成功的携带hHCN4基因的重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP(目的基因组)转染大鼠BMSCs； 3.在荧光显微镜下，观察转染目的基因后的BMSCs中绿色荧光蛋白的表达情况； 4.用RT-PCR法检测转染后BMSCs中mRNA的表达情况； 5.用Western Blot法检测转染后BMSCs中目的基因组表达目的基因蛋白。 结果 1.BMSCs成功分离纯化及贴壁传代：倒置显微镜可见经原代培养贴壁的BMSCs大多数为呈克隆样生长的成纤维样的梭形细胞；经传代后生长状态良好。免疫细胞荧光法见BMSCs表面抗原CD90、CD44呈阳性表达，阳性率分别为96.74%和94.36%。 2．成功将目的基因组转染大鼠BMSCs，获得了表达hHCN4基因的BMSCs。 3.转染24h后的BMSCs中可见表达绿色荧光蛋白，且绿色荧光蛋白的表达及分布不存在明显差异，转染效率约为20-30％。 4.用RT-PCR法检测到转染后BMSCs中目的基因组有hHCN4mRNA的表达； 5．用Western blot法检测到转染后BMSCs中目的基因组有hHCN4基因蛋白水平的表达。 结论 1．BMSCs可以通过密度梯度离心法及贴壁培养法被成功分离纯化及传代。 2.采用荧光显微镜观察及RT-PCR法、Western blot法检测转染后的BMSCs，证实将携带hHCN4基因的重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外可以成功转染大鼠BMSCs，并能够表达hHCN4mRNA和蛋白。
【关键词】：人超级化激活环化核苷酸门控通道4基因(hHCN4) 腺病毒载体 基因转染 骨髓间充质干细胞(BMSCs) 生物起搏
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文论著摘要4-6
• 英文论著摘要6-9
• 英文缩略语表9-10
• 前言10-11
• 实验材料与方法11-21
• 结果21-24
• 讨论24-26
• 结论26-27
• 本研究创新性的自我评价27-28
• 参考文献28-31
• 附录31-45
• 综述31-42
• 参考文献37-42
• 在学期间科研成绩42-43
• 致谢43-44
• 个人简历44-45

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：937635